[분자유전학실험]5.SDS-PAGE

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Material & Method
4. Result
5. Discussion
6. Reference

본문내용

되는 방법 몇 가지가 있다.
1) Rapid Staining 방법 (시간적으로 짧다는 장점이 있다. : 소요시간 70분)
- 용액준비
- 염색방법 : 고정액에서 20분간 고정한 후 증류수로 5분씩 2회 세척한다. Silver staining solution을 30분간 처리하고, 증류수로 gel을 가볍게 씻어준다. 그리고 Developer에서 원하는 강도가 나올 때까지 반응시킨다. 이 후 고정액으로 반응을 정지시킨다.
※ 주의 : 모든 용액에서 formaldehyde는 사용직전에 첨가해야 하며 염색강도는 formaldehyde의 첨가량에 따라 달라지므로 실험자가 이를 자기에게 맞는 조건으로 조절해 줄 필요가 있다. 용기는 가능한 깨끗한 유리용기를 사용해야 하며 gel을 절대로 맨손으로 만져서는 안 된다. 짧은 시간간격으로 Fixing/washing을 반복해 주면 그만큼 강도가 증가된다.
Developing시간이 길어지면 background가 많이 나올 수 있다.
2) Monochromatic 방법 (소요시간 1.5hr)
- 용액준비
- 염색방법 : Gel을 50% MtOH로 1시간 고정시킨다. Gel을 Staining Solution 으로 15분간 염색하고 (사용직전 100ml Sol II에 4ml Sol I를 한 방울씩 첨가하여 제조한다 ) Gel을 증류수로 5분간 세척한다. Developer로 5-10분간 원하는 염색강도가 나타날 때까지 처리한 후 증류수로 가볍게 세척해 주고 50% MtOH로 고정한다.
3) Polychromatic 방법 (소요시간 1Day + 5hr)
- 용액준비
- 염색방법 : Gel을 50% MtOH/10% acetic acid로 밤새 고정한다. Gel을 증류수로 1시간씩 3회 세척한 후 0.19% Silver nitrate로 1시간 처리한다. 증류수로 가볍게 세척하고 Reducing agent를 8-10분간 처리한다. Developer로 1-2시간 원하는 염색강도가 나타날 때까지 처리한 뒤 증류수로 가볍게 세척해 주고 50% MtOH/10% acetic acid로 반응을 정시시킨다.
2. SYPRO staining
1) SYPRO Orange or Red Stain
Fluorescent염색은 상당히 좋은 민감도와 mass spectrophotometry에 사용 가능한 방법이다. 일반적으로 Coomassie blue보다는 민감도가 높고 silver staining보다는 민감도가 낮다. 또한 SYPRO orange가 SYPRO red보다 민감도가 더 낮다. 그러나 SYPRO orange는 가끔 background에 얼룩이 생기는 경우가 발생한다.
- 염색방법 : Gel을 고정액에 넣고 20분 동안 50 rpm 에 흔들어 준다. 그리고 액을 버리고 다시 한 번 시행한다. (이때 overnight이 가능 합니다). 이 후 세척액에 20분 동안 두 번 50rpm으로 흔들면서 세척해준다. SYPRO orange or red 염색액을 1시간 동안 50rpm으로 방치한다. (감도를 높이려면 4시간까지 염색을 합니다) 마지막으로 gel scanner로 스캔한다.
2) SYPRO Ruby Stain
Silver staining만큼의 민감도를 가지며 실험자는 실험 경험이 많아야 좋은 결과를 얻을 수 있다. SYPRO Ruby는 형광염색으로 2D electrophoresis에 많이 사용하며 Coomassie blue보다 민감도가 높으며 silver staining보다는 민감도가 떨어진다. Staining이 빠르며 염색 후 mass spectrophotometry에도 사용이 가능 하다.
- 염색방법 : 10% methanol, 7% acetic acid에 30분 * 3회 50rpm에 방치한다. (마지막 과정에서 overnight가 가능 합니다) 3시간 동안 염색액으로 염색을 한다. 10% methanol, 7% acetic acid으로 30분간 세척해준 후 Gel을 스캔 한다.
3) Reverse stains
Reverse staining 방법에 사용되고 있는 시약에는 Potassium chloride, copper chloride, zinc chloride, cobalt acetate, nickel chloride, zinc chloride-imidazole 등이 있는데, 최근까지 개발된 방법 중 zinc chloride-imidazole를 이용한 염색 방법이 가장 민감하다. 또한 reverse stain은 5-15분 정도에 시간으로 염색이 가능하다.
-Imidazole-Zinc staining
단백질에 imidazole을 첨가하면 결합되지 않았거나 결합이 약한 zinc 이온은 zinc-imidazole 형태로 바로 침전되지만 단백질과 강하게 결합된 이온은 침전되지 않는다. 이러한 원리에 의해 젤 상에서 단백질의 위치가 명확하게 구분될 수 있다. 검출 한계는 방법에 따라 10-500ng이고 linear dynamic range는 10-100ng 정도이지만 검출된 단백질을 단백질 동정 기술과도 호환이 가능하다.
- 염색방법 : 1% sodium carbonate에 gel을 5분간 처리한다. imidazole solution에 gel을 15분간 처리한다. (200 mM imidazole, 0.1% SDS) 증류수로 1분간 세척해준 후 0.1 M zinc acetate에 넣고 충분히 Developing 될 때까지 처리한다. 증류수로 5분간 2회 헹구어서 destaining합니다.
[Figure 3. 각 염색방법에 의한 사진]
6. Reference
분자생물학 2판 / Robert F. Weaver / 라이프사이언스 / 2003. 2
http://www.genehunters.co.kr/Training/03_3.htm
http://www.elpisbio.com/sub/support/protocols/Staining.htm
http://www.genehunters.co.kr/Training/03_1.htm
http://www.elpisbio.com/sub/support/protocols/Protocols.htm
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