경희대학교 분자생물학 실험 - 대장균 PLASMID 재조합 DNA 확인

소개글

경희대학교 분자생물학 실험 - 대장균 PLASMID 재조합 DNA 확인에 대한 보고서 자료입니다.

목차

Introduction
-solution 1,2,3
-EDTA
-miniprep.
-흡광도(absorbance , optical density)
-감색효과 (hyperchromic effect)
Materials & Procedure
Result & disscusion

본문내용

ute DNA, add 50 μl of Buffer EB to the center of each QIAprep spin column, let stand for
1 minute and spin for 1 minute
16) mix 2 μl of miniprep DNA and 8 μl of sterilized DDW with 2 μl of 6X loading
→ Total 12 μl!!
17) load onto an agarose gel
18) gel electrophoresis (~100V) for about 20 minutes
19) what do you see in the gel? check for the plasmid DNA band
20) store minipreped DNA frozen
Result
실험결과 모든 조의 DNA가 Marker의 5/6# band에 표지됨을 확인, 이로인하여 size는 3~4kb정도로 유추할수 있다.
Disscusion
이번 실험은 그동안의 실험을 최종적으로 확인하는 것과 같은 개념으로, 첫 실험에서 재조합한 plamid DNA pGEX6P-1 (with geneX)를 com.cell에 삽입 후 배지에서 배양 후 나타나는 Colony를 추출, 분해하여 검출되는 DNA가 일련의 pasmid DNA pGEX6P-1이 나오는지를 관찰하는 실험이다. pGEX6P-1 과 geneX는 BamH1과 Xho1으로 잘려진 형태로 존재한다. 그래서 다음과 같은 Plasmid가 존재하는 Com.cell이 존재할 수 있다.
정상적인 결합
(pGEX6P-1 + GeneX)
GeneX끼리 결합
pGEX6P-1끼리 결합
Amp 배지에서 생존가능,
정상적 발현
Amp배지에서 사멸
Amp 배지에서 생존 가능하나 생성확률 극히 낮음.
먼저, 지난 실험에서 만든 배지에서 실험에 사용할 Colony를 2개정도 추출해서 Amp가 들어간 LB에서 37℃의 온도에서 키운다. 실험을 위해서는 Incubation을 직접 해야 하는데, 시간관계상 전일 조교님이 직접 Incubation 시킨 것을 사용하였다.
DNA double strand는 조건에 따라서 각각의 strand가 서로 떨어지기도 하고 붙기도 하는데
이 DNA가 떨어지는 현상을 denaturation 이라고 하고, 다시 붙는 것을 hybridization 이라 하며 이것은 다음과 같은 관계를 가진다.
Low
High
온도
hybridization
denaturation
Salt의 농도
denaturation
hybridization
pH
hybridization
denaturation
denaturation
hybridization
E.coli에는 Plasmid 말고 chromosal DNA가 존재하기 때문에 만약, Plasmid DNA와 linear DNA를 구분하지 않는다면 이후 electrophoresis의 결과에서 영향을 미칠 수 있다. 그래서 본 실험에서는 NaOH로 PH를 올려 DNA를 denaturation 시키고 potassium acetate로 pH를 급격히 7.0까지 복구시키면 크기가 작고 supercoiled form을 유지하고 있던 plasmid는 hybridization이 잘 되지만, chromosal DNA는 미처 hybridization 되지 못하고 엉기게 된다. 이렇게 엉긴 chromosal DNA를 원심분리로 제거하면 상층액에 plasmid DNA가 있게 되어 분리가 가능하다.
이렇게 분리한 plasmid DNA에 P2 buffer(DNA분리 정제용 lysis buffer)를 넣고 흔들어 주면, 색깔이 파란색으로 변한 뒤 N3 buffer(Neutralization Buffer)를 넣고 다시 흔들면 무색으로 돌아오는 것을 볼 수 있는데 우리조의 경우 두 개의 tube 중 한 개만 p2buffer 넣어 파란색이 되는 반응을 관찰할 수 있었다. procedure상에서 N3 buffer를 350μl 을 넣었어야 하지만 실수로 250μl 밖에 넣지 않아 이후 ice incubating 도중 100μl를 추가로 더 넣었는데 실험결과에는 별다른 영향을 미치지 않았다.
Electrophoresis 이후에 DNA flourscent 후 관찰한 DNA의 크기는 첫실험에서 pGEX6P-1이 나타낸 5kb보다 한단계 낮은 3~4kb를 나타내었는데, 이는 사실 supercoiled form의 DNA가 Denaturation 과 Hybridization을 겪으면서 완벽한 본래의 supercoiled form으로 복구가 되지 않기 때문에, 실험결과상 Band가 다르게 보일지라도 결과적으로는 colony에서도 같은 pGEX6P-1이 발현 되었음을 알수 있다.
흡광도는 빛이 어떠한 매체를 통과할 때, 그 매체에 의한 흡수된 빛의 값을 측정하는 것으로 매체가 포함한 물질의 농도를 관측 할 수 있다. DNA 농도는 260nm에서 관측하는데 OD값이 1일때, DNA 의 농도는 50μg/μl 이고, RNA의 경우 농도는 40μg/μl이다. 같은 DNA 농도 일 때, double strand 보다 Single strand 일 때 빛의 간섭이 적어지므로 더 많은 빛을 흡수, OD값이 더 크다. Hyperchromic effect 으로 260nm에서 관찰한 값과 280nm에서 관찰한 값을 나누어서 나오는 값이 1.7에 가까울 수록, 순수한 DNA가 추출된 것이며 1.7보다 작을 경우 단백질에 의한 오염을, 1.7보다 클 경우 RNA에 의한 오염을 의심할수 있다. 원래 본 실험은 NANO drop을 이용해서 스펙트럼을 측정하여 포함된 DNA의 농도를 계산 하는 것으로 끝이 나지만, 실험기계의 이상으로 인한 부득이 하게 농도측정을 할 수 없었다.
Reference
1. University of queensland diamantia institute
" The Alkaline Lysis Mini-Plasmid Preparation"
2. 위키백과 “에틸렌다이아민테트라아세트산“
3. QIAGEN "QIAprep Spin Miniprep Kit"
4. 네이버 지식사전 “흡광도, hyperchromic effect"

키워드

Xho,   plasmid DNA,   E.COLI,   PGEX,   EDTA,   solution 1,   solution 2,   solution 3