[전공실험] 효소의 고정화 및 반응효율의 측정과 비교

소개글

[전공실험] 효소의 고정화 및 반응효율의 측정과 비교에 대한 보고서 자료입니다.

목차

[Introduction]

[본문]
1단계 – 준비 및 효모의 배양
2단계 – 전세포 효모 효소 제조
3단계 – 효모 효소 반응
4단계 – 효모 효소의 고정화
5단계 – 고정화 효소 반응

본문내용

)
6)40mM pNPP stock solution 0.5ml를 넣는다.
7)30℃로 지정한 waterbath에서 10분간 incubation 한다.
8)효모 효소가 포함되지 않은 대조군 conical tube(buffer+pNPP만 들어가있음)를 cuvette에 옮겨 410nm spectrophotometer에서 blank로 지정한다.
9)고정화 효소(bead)가 포함된 tube에서 bead 제외한 반응액을 cuvette으로 옮기고 흡광도를 측정한다.
10)측정된 흡광도로부터 전제포 효모 효소의 g당 Unit을 계산한다.
11)고정화된 효소 비드의 크기를 측정하고, 확산계수를 10^-9m/s로 가정하고 고정화 효소의 효율감소를 계산한다.
<결과>
① 고정화효소 g당 Unit
흡광도=0.255
→p-nitrophenolate 농도=0.255/16200=0.0000157M=15.7M
Buffer 5ml+pNPP 0.5ml = 총 반응액 5.5ml
→(5.5×)×15.7=0.086mol.
→0.005g의 효모에 의해 총 0.086mol p-nitrophenolate 생성되었다.
10분간 waterbath에서 incubation
∴고정화효소활성= 0.086mol÷(0.005g효모효소×10min)
=1.76U/g효모효소
☆고정화효소를 했을 때 내부물질전달현상이 생기므로 효소반응속도가 감소되므로 고정화효소를 안했을 때보다 효소활성 감소
고정화 효소의 효율감소
:우리가 만든 bead는 총 430개로, 개당 효모효소가 0.000016g 들어가 있다. 비드의 지름은 0.15cm=0.0015m
De=고정화 담체에서 기질의 확산계수 = m/s로 고정화를 했을 때 효소의 활성이 감소하는 것은 확산제한 때문에 감소되는 것임을 알 수 있다.
고정화 안했을 때 효소 활성
고정화 했을 때 효소 활성
2.86U/g효모효소
1.76U/g효모효소
∴효모 효소를 고정화 했을때 ()=0.61로 그냥 효모효소의 활성보다 61% 활성이 감소되었다. 그러므로 활성감소율은 39%이다. ㅎ
<1이므로 물질전달속도는 반응속도보다 훨씬 크고, 이 반응은 물질전달에 의해 영향받는다. 아래 그래프에 의해 유효인자 0.6로 Thelemodulus가 3임을 알 수 있다.
<토론>
우리는 처음부터 효소의 양이 많지 않아서 효모효소 0.005g을 넣고 모든 bead를 다 넣고 실험측정을 하였다. 다른조를 보니 모두 bead의 양을 다르게 넣고 흡광도를 측정했었는데, 우리조는 같은 양의 효모효소의 흡광도를 고정화효소에 넣고 재었을 때 고정화효소의 활성이 고정화를 하지않았을 때보다 감소한다는 것을 알아내는게 실험의 취지로 생각했기 때문에 우리가 맞다고 생각하였다. 또한 앞단계에서 효모효소의 양을 너무 많이 써버려서 이렇게 할 수밖에 없었다. 5단계 실험에서 bead 430개를 다 넣고 시간에 따른 활성을 재야 고정화효소의 Km과 Vm를 구할 수 있는데 실험을 조금 잘못 한 것 같다. 확산계수와 bead의 크기를 사용하여 효소활성감소를 구하려고 했지만 책을 찾아보아도 찾을 수 없었다..T_T
▣ 5단계 : 고정화 효소 반응
1) 15mL conical tube에 각각 고정화된 효모 효소(비드)를 넣고, reaction buffer(4단계에서 사용한)를 반쯤 넣은다.
-고정화된 효모효소(비드)를 15mL conical tube에 4개에 각각 30개,60개,90개, 180개를 넣어 준다.
2) 여기에 pNPP의 최종 농도가 4mM(0.5mL)이 되도록 첨가한다.
3) 2)과정 까지 거친 15mL conical tube를 30도의 water bath에 넣은 뒤 일정 시간 간격을 두고 sample을 일회용 피펫으로 채취한다.
4) blank cuvette를 바로 spectrophotometer에 넣고 410nm에서 흡광도를 0으로 맞춘다.
고정화 효소가 포함된 tube에서 고정화 효소를 제외한 반응액을 cuvette으로 옮기고 410nm에서 흡광도를 측정한다.
5) 아래와 같이 기록하고 그래프로 나타낸다. (30도 Water bath에서) →<표1>
<결과>
-실험 1) 비드 수는 동일(180개), 10분 간격으로 흡광도 측정.
<표1: 실험 1의 결과>
비드 수
시작 시간
측정 시간
반응시간
A410
농도
180개
11:23
11:33
10min
0.203
12.53uM
11:35
11:45
10min
0.262
16.17uM
11:48
11:58
10min
0.400
24.69uM
12:03
12:13
10min
0.563
34.75uM
12:15
12:25
10min
0.572
35.31uM
12:27
12:37
10min
0.616
38.02uM
12:40
12:50
10min
0.716
44.20uM
-실험 2) 비드 수 30, 60, 90개 각각 30분 간격으로 2번씩 측정.
<표2 : 실험2의 결과>
비드 수
시작 시간
측정 시간
반응 시간
A410
농도
30개
11:53
12:27
12:23
12:57
30min
30min
0.051
0.107
3.15uM
6.60uM
60개
11:53
12:27
12:23
12:57
30min
30min
0.171
0.294
10.56uM
18.15uM
90개
11:53
12:27
12:23
12:57
30min
30min
0.230
0.346
14.20uM
21.36uM
☞ Spectrophotometer에서 흡광도가 0.1~0.8 사이여야 효소의 활성 값을 정확히 얻을 수 있으므로 비드 수 30개의 30분 반응 시 0.051은 그 값을 만족시키지 못한다.
<시간에 따른 흡광도 변화 그래프> <시간에 따른 농도 변화 그래프>
⇒변수 : 시간 ⇒변수 : 효소의 양
x축 :　Time (min), y축 :　흡광도 A (nm) x축 : Time(min), y축 : 농도(uM)
<토의>
- 반응 시간을 늘릴수록 흡광도가 증가 하였다.
- <표2>에서 비드 개수를 다르게 하여(30개, 60개, 90개) 30분 간격으로 두 차례 측정 했을 경우 모두 증가 하는 모습을 볼 수 있는데, 개수가 많을수록 흡광도가 더 높게 나타났다.
- 흡광도(A) = 30개 < 60개 <90개

키워드

생물공학전공실험설계,   효소의 고정화 및 반응효율의 측정,   효소의 고정화,   전세포 효모 효소 제조,   YPD배지 만드는 과정,   pNPP,   전공실험