[기기분석] TLC를 이용한 아미노산의 정성분석

소개글

[기기분석] TLC를 이용한 아미노산의 정성분석에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Theme
2. Date
3. Purpose
4. Principle
5. Reagent & Equipment
6. Method
7. Result
8. Discussion

본문내용

능의 차 등을 이용해 혼합물을 분리·정제하는 조작법의 하나
미량 물질의 분석수단으로 이용됨
2) 원리
: 이동상은 시료를 함유한 고정상으로부터 시료를 녹여내는데, 용질이 여기를 천천히 지나가 새로운 고정상에 닿으면, 두 상에 대한 물리적·화학적 상호작용의 정도에 따라 흡착 또는 분리가 일어남
고정상과 이동상의 계면에서는 흡착제와 친화성이 강한 성분일수록 용출되어 이동하는 비율이 적어지고, 고정상 속에 머무는 비율이 커짐
→ 친화성에 근소한 차가 있으면 이동속도에 차이가 생겨 혼합물의 분리가 가능
※ 구성요소
고정상(stationary phase) : 물질에 대한 친화성(유지력)이 있고 이동하지 않는 상
이동상(mobile phase) : 고정상에 대해 상대적으로 이동하여 나가는 기체 또는 액체의 상
3) 분류
[그림 1] 크로마토그래피의 분류
(1) 이동상의 종류에 의한 분류
이동상이 기체(gas)인 경우 : Gas chromatography(GC)
이동상이 액체(liquid)인 경우 : Liquid chromatography(LC)
(2) 액체 크로마토그래피(LC)의 분류
흡착 크로마토그래피(Adsorption chromatography)
: 시료가 고정상에 흡착되는 정도로 분리
분배 크로마토그래피(Partition chromatography)
: 고정상과 이동상 사이에 시료가 분배되는 차이를 이용
ex) 정상(Normal phase) - 고정상 극성, 이동상 비극성 / 비극성 화합물이 먼저 분리됨
역상(Reverse Phase) - 고정상 비극성, 이동상 극성 / 극성화합물이 먼저 분리됨
이온교환 크로마토그래피(Ion-exchange chromatography)
: 산, 염기 또는 완충용액을 이동상으로 하여 용질 이온상과 고정상 이온 간의
이온교환에 의해 용질 이온을 분리
겔투과 크로마토그래피(Size exclusion chromatography)
: 다공성 비이온성 겔을 고정상으로 사용하여 분자를 크기에 따라 분리
ex) Gel filtration chromatography(GFC), Gel permeation chromatography(GPC)
친화 크로마토그래피(Affinity chromatography)
: 특정 생체고분자에 친화성 있는 물질을 불용성의 담체에 화학적으로 결합시켜 고정상으로 하고 친화력 있는 것과 없는 것으로 분리
얇은막크로마토그래피(TLC, thin layer chromatography)
1) 정의
: 유리판 위에 흡착제의 얇은 층(250μm 전후)을 만들어 이것을 고정상으로 하고, 유기용매를 전개유동상으로 한 크로마토그래피
[그림 2] 고정상(실리카겔)과 이동상의 구조
2) TLC의 장단점
(1) 장점
분석이 신속함
아주 작은 양으로도 시료를 분석할 수 있음
동시병렬분석이 가능함
- 5mm 간격으로 시료를 부착시키면, 10개의 시료를 동시에 전개할 수 있음
모든 성분이 확실하게 나타나 있음
- GC같이 컬럼의 말단에서 모니터하는 방식은 시료의 모든 성분이 유출하였는지의 여부가 명확하지 않고 분석의 종말점을 알 수 없음
(2) 단점
정밀도 재현성이 일정하지 않음
조작이 불편함
정량성에 문제점이 있음
3) TLC기구 및 재료
[그림 3] 고정상과 이동상 및 분리 과정
(1) 흡착제
① 실리카겔(silica gel) : 가장 일반적으로 사용됨
200mesh 정도로 입도를 고루 갖춘 것을 사용함
농약이나 PCB, 페놀류, 지방산 등 중성 및 산성물질의 분리에 적합
② 알루미나(alumina) : 실리카겔과 같은 입도로 조제된 것
고리 방향족탄화수소, 지질, 알칼로이드 등 중성이나 염기성물질의 분리에 적합
③ 셀룰로오스분말 : 알칼로이드 등의 분리에 사용
④ 그 밖 : 규조토, 프리지질, 산화마그네슘, 탄산마그네슘, 황산칼슘, 이온교환수지 등
(2) 전개용매
: 시료의 용해도가 너무 좋으면 정지상에 머물지 않고 용매 앞부분과 같이 이동하여 분리가 되지 않으며, 난용성 용매에서는 시료가 움직이지 않음
→ 이 중간에서 분리를 고려하여 용매 조성을 결정
무극성 용매 : 석유에테르, 헥산 등
극성용매 : 메탄올, 물, 피리딘, 유기산 등
중간에 사염화탄소, 클로로포름, 에틸에테르, 에스테르, 아세톤 등이 있음
※ 전개용매의 극성순서
Acetic acid > Water > Methanol > Ethanol > Acetone > Pyridine > Ethyl acetate > Chloroform > Diethyl ether > Dichloromethane > Benzene > Carbon tetrachloride > Cyclohexane > Petroleum ether
(3) 발색시약
: 전개 후 성분의 분리를 눈으로 보고 확인할 때 유색성분이면 문제가 없으나, 색이 없는 성분에서는 적당한 발색시약을 분무하여 해당성분의 반점의 위치를 확인함
① 황산 : 분무 후 전개판을 120℃ 정도로 가열하고 유기물을 검게 만듬
② 삼염화안티몬-클로로포름용액(포화) : 스테로이드, 비타민 A등을 푸른색으로 발색시킴
③ 요오드, 브롬 : C=C, P=O, P=S 등의 이중결합에 흡수되어 갈색을 나타냄
④ 질산은-에탄올 용액 : AgNO3 0.5% 용액은 유기인제, 2% 용액은 PCB의 확인에 쓰임
⑤ pH 지시약 : pH 지시약의 메탄올 용액은 산, 염기의 확인에 쓰임
(4) 전개판 :보통 20×20 cm의 두꺼운 유리판 사용
최근에는 공장생산에 따라 두께 정밀도가 좋은 얇은 층을 형성시킨 TLC 판이 시판되고 있고 이에 따라 TLC의 신뢰성이 증가함
전개판의 제작
① 깨끗하고 건조된 판을 종이 타월위에 올려놓고, 슬러리를 판을 따라 평평하게 부은 다음 유리막대를 이용하여 판의 끝까지 펴줌
② 이러한 조작을 부드럽게 코팅될 때까지 여러 번 반복
③ 바람으로 말리고 층이 굳은 다음부터 건조기에 넣고 100℃에서 30분~2시간 가열하여 흡착제를 활성화함
④ 방냉한 다음 사용하나, 온도가 높을 때는 건조기 속에서 방냉하는 편이 좋음
※ 이 조작에서 두께의 균일도, 활성화 정도에 따라 분석의 재현성이 많이 좌우됨

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