[미생물실험]대장균 배양과 키트를 이용한 동정

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[미생물실험]대장균 배양과 키트를 이용한 동정에 대한 보고서 자료입니다.

목차

EXP1. 일반고체배지(한천배지) 만들기
EXP2. 액상배지 만들기
EXP3. 최적확수법(액상배지)과 선택배지(Endo배지, m-FC배지), 평판도말법(NA배지)
EXP4. 순수배양(1)〈m-FC배지→Endo배지〉
EXP5. 순수배양(2)-계대배양<Endo배지→NA배지>
EXP6. 그람염색
EXP7. 키트를 이용한 세균동정(장내세균과 동정)

본문내용

: 키트(API20E 스트립), 계대배양균(NA배지)-5조:금호강, 루프, 결과지, 펜, TDA시약, VP1시약, VP2시약, NIT1시약, NIT2시약, 마이크로피펫, 피펫 팁, 마이크로 튜브, 증류수, 과산화수소(H2O2), 배양기, 클린벤치(무균대), 광유, oxidase 시약, Whatman paper(와트먼지)
Ⅰ. Introduction (서론)
각종 세균의 생화학적 성상을 이용하여 세균을 동정할 수 있도록 손쉽게 정리된 동정용이다. 따라서 여러 가지 생화학 반응을 배지를 따로 만들어서 사용하지 않아도 손쉽게 검사할 수 있는 이점이 있다.
API20E kit는 장내세균과 무리 및 다른 그람음성세균의 동정에 사용되는 통상의 시험법을 소형화한 생화학적 반응으로 3개씩 묶어 양성 반응에 부여된 수치를 합하여 7자리의 숫자로 표시한다. 이 번호를 인덱스에서 찾아 동정을 알아낸다. API index에는 장내세균과 그 밖의 그람 음성 간균 약 1000개의 생화학적 반응 양상이 들어있다. 이 체계는 20개의 분리된 구획을 가진 플라스틱 스트립을 사용한다. 각각의 구획은 1개의 움푹 파인 구덩이인 각두와 특이적 탈수배지가 든 1개의 작은 관(tube)으로 구성된다. 각 구획에 접종하기 위해서는 먼저 모르는 미생물이 든 식염수현탁액을 만드는 것이 필요하다. 이 체계는 장내세균과 뿐만 아니라 비장내세균의 동정에도 이용이 될 수도 있지만 이번 실험에서는 한 개의 집락을 가지고 생화학적 시험을 할 수 있는 키트를 이용하여 장내세균과의 동정에 이용할 것이다.
Ⅱ. Method (본론/방법)
① 클린벤치(무균대)에 API20E 스트립을 준비했다.
② 마이크로피펫을 이용하여 증류수를 마이크로튜브에 넣고 순수배양해둔 배양균(5조-금호강)을 화염멸균된 루프를 이용하여 증류수에 잘 희석시켰다. (현탁세균액을 만들었다.)
③ 마이크로피펫을 이용하여 키트의 20개의 튜브에 채워 넣었다.
(이름밑에 ‘_’ 되어있는 ADH, LDC, ODC, H2S, URE 구획에는 관 부분까지만 채우고, 이름 밑에 ‘U’되어 있는 CIT, VP, GEL 구획에는 완전히 차도록 채웠다.)
④ 혐기적인 조건을 만들어주기 위해 ADH, LDC, ODC, H2S, URE 구획에는 마이크로피펫을 이용하여 광유로 큐플 부분을 채웠다. (이때, 현탁액을 채우는데 쓴 팁은 버리고 새로운 팁을 이용한다.)
⑤ 스트립을 모두 채운 후, 배양용 박스 바닥에 증류수를 조금 붓고 스트립을 넣고 뚜껑을 닫았다.
⑥ 펜을 이용해 조와 이름을 쓰고 35℃배양기에 배양했다.
⑦ 배양이 끝난 후 시험용 시약을 첨가하여 나타나는 결과를 판독표를 보고 판정하고, 양성(+)인 것을 모두 합산해 결과코드를 산출했다.
-TDA검사: TDA시약 한 방울 떨어뜨려 갈색으로 변하면 양성.
-IND검사: JAMES시약을 한 방울 떨어뜨려 전체가 분홍색으로 변하면 양성.
-VP검사: VP1, VP2시약을 각각 한 방울씩 떨어뜨려 10분 후 분홍색이나 빨간색으로 변하면 양성, 옅은 분홍색으로 변하면 음성으로 간주.
-NO2검사: NIT1시약과 NIT2시약을 GLU튜브에 각각 한 방울씩 떨어뜨린 후 2~5분 후 빨간색을 나타내면 양성, 노란색은 음성.
* oxidase 검사(산화효소 존재여부 확인): Whatman paper위에 oxidase 시약을 한 방울 떨어뜨린 후 NA배지위의 균 일부를 화염 멸균시킨 루프를 이용하여 조금 떼어내고 Whatman paper위에 문지른 후 색의 변화를 관찰하였다.
-1~2분내에 잔한 청색이 되면 양성 반응이다.
* H2O2→카탈라아제 검사(기포생성 여부): 과산화수소를 한 방울 떨어뜨린 후 기포의 유무를 관찰하였다.
Ⅲ. Result(결론)
-1번 키트 결과:
-2번째 키트 결과:
SAC가 양성으로 판정했을 때
SAC가 음성으로 판정했을 때
⇒대장균으로 판정.
Ⅳ. Discussion(고찰)
미생물 동정에 사용하는 API 20E kit를 이용하여 미생물을 동정해 보았다. API 20E kit는 그람 음성 간균이나 장내 세균은 검출할 때 사용하는 kit로 즉각적인 미생물 검출에 사용할 수 있다. 실험 과정 중에 현탁세균액을 만드는 것이 있는데 조원 모두 계대배양에 실패하였기 때문에 5조의 배지를 빌렸다. 이를 제외하고 실험과정과 결과에서 오류가 생길 만한 점은 없었던 것 같다. 다만 실험 결과 중 양성과 음성 결과를 구분하기 힘든 부분이 몇 가지 있었는데 이는 실험을 처음 접하는 우리가 판단하기에 애매한 변화를 보였기 때문이다. 이 실험에서 나온 결과 값도 결과표에 기록하여 동정을 실시하여 실험의 정확성을 높였다. API 20E kit의 작용 기작도 알았고 어떤 원리로 미생물을 검출 하는지도 배울 수 있었다. 미생물을 동정하는 데에 많은 시간과 힘든 실험 과정만 있는 것이 아니고 이렇게 빠른 시간에도 미생물의 동정이 가능 하다는 점도 배울 수 있었다.
Ⅴ. Reference(참고)
1. [두산백과]배지
(http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=1099912&cid=40942&categoryId=32330)
2. 미생물학 실험 수업보도자료, API20E 키트 사용법 프린트
3. 최신 미생물 실험, 오계헌 외4명, 신광문화사, 2005.09.10
4. 생물학 실험서, 박용철 외 3명 , 국민대 출판부, 19~30p, 2010
5. 미생물학 실험서, 한국미생물학회, 을유문화사, 1998
6. 미생물학 실험2판, 이혜주, 동아대학교 출판부, 2013.09.06
7. 벤슨의 미생물학 실험, 이건형 외 16명, 동화기술, 2015.09.10
8. [개정신판]미생물학 실습, 하윤문 외 1명, 고문사, 1995.10.15
9. [네이버 생명과학대사전]대장균
(http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=424477&cid=42411&categoryId=42411)
10. 그람염색
(http://blog.naver.com/kiss5645?Redirect=Log&logNo=140166460179)
11. 키트 결과코드 동정(http://apiweb.biomerieux.com)

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