[환경미생물 실험] 최확수법(MPN Method)

목차

▣ 최확수법(MPN Method) 이론 ▣
◉ 기구 및 재료

▣ 실험 방법 ▣
◈ 검체의 채취 및 보존 ◈
추정실험(presumtice test)
◉ 확정실험(confirm test)
◉ 완전실험(complete test)
※ 기구 및 재료 ※
※ 염색방법 ※
※ 그람염색 이론 ※

◉ 결과 ◉
◎ 최확수 계산법 ◎
※ 3-3-3 법 ※
◎ 최확수법 계산결과 ◎
◎ 그람염색결과 ◎

◉ 고찰 ◉
◎ 대장균군을 검출방법◎
※ 토마스식에 의한 MNP 계산법 ※

본문내용

100mL
◎ 그람염색결과 ◎
1조
윤재영 : / 1mL
분홍색 (그람음성)
조혁수 : / 0.1mL
분홍색 (그람음성)
최덕헌 : / 0.1mL
분홍색 (그람음성)
3조
/ 1mL
분홍색 (그람음성)
/ 0.01mL
분홍색 (그람음성)
/ 0.01mL
분홍색 (그람음성)
고찰
이 번 실험은 배양하는 기간이 있어 3번에 걸쳐 실험을 하였고 처음 보는 마이크로 피펫을 사용해 보기도 하였다. 마이크로 피펫 가격이 상당히 비싸 조금 놀랐다.
미생물실험서적 및 수질오염공정시험법 총대장균군과 비교하였을 때 추정, 확정, 완전실험이 우리가 실험한 것과 다르게 나와 있었다. 확정실험과정이 우리가 실험한 EMB배지가 아닌 BGLB배지에 관한 내용이었다. 그 점이 궁금하여 교수님께 여쭈어 보니 확정실험과정에는 BGLB배지, Endo평판배지, EMB 한천평판배지 등 여러가지를 사용한다고 말씀하셔서 궁금증이 해결되었다. EMB배지에서 대장균군은 녹황색의 광택을 가지는 집락을 형성한 것을 관찰하였다.
27개의 실험관에 10㎖의 Lactose broth를 넣은 후 각 실험관 안에 포함된 다람발효관(Durham tube)시험관에 공기가 들어가지 않도록 뚜껑을 닫고 흔들어 주고 다람발효관(Durham tube)시험관 안에 공기가 들어가지 않도록 시험관을 뒤집어 흔들어 준다. 만약 시료 안에 대장균군이 있다면 배지 속에 유당을 분해하여 가스 또는 산을 생성하며, 배양 후 이 가스는 다람발효관(Durham tube)시험관에 모인다.
EMB한천배지 제조법은 펩톤 10g, 유당 10g, 무수 인산일수소칼륨 2.0g, 정제한천분말 18.0g, 에오신 0.4g, 메틸렌블루우 0.065g을 증류수 1,000㎖에 넣고 가열하면서 녹여 pH7.1이 되도록 하고 121℃에서 15분간 고압증기로 멸균하여 사용한다.
이 밖에 대장균군을 검출하는 방법에는 MPN법을 비롯하여 데속시클리이트 배지에 의한 평판배지법, membrane filter법과 같은 방법도 있다.
◎ 대장균군을 검출방법◎
▶ MPN법 : 완전시험까지 하면 대장균군에 속한 세균을 확인할 수 있어 정확도가 높다.
▶ 데속시클리이트 배지에 의한 평판배지법 : 최고로 간편하지만 대장균군만을 계수할 수 없다.
▶ membrane filter : 대장균군수가 조금 있을 때 대단히 유효하다.
대장균군의 종류에는 Escherichia Coli (대체적으로 사람, 가축, 온혈동물의 배설물에서 발견되므로 FecolPollution Indicator로 사용된다. 이것이 발견되면 물이 분뇨로 오염된 것을 알 수 있다.), Inter mediate Aerobater Aerogens (이 균은 자연계의 초원이나 흙속에서 발견되는 것으로 분염의 오염과는 상관없다.) , IAC(Intermedoate-Aerogenes-Cloacae) 동물의 배설물, 오수 등에서 발견된다. E.Coli보다는 그 수가 적다.) 등이 있다.
참고로 Bacillus lactis cloacae 분뇨에 의한 오염의 여부를 정확히 알려면 E.Coli과 A.Aerogenes를 감별해야 하나 이 감별은 쉽지 않고 일관하여 대장균군으로 취급한다.
대장균 관찰이 중요한 이유는 수질지표로 사용되기 때문인데, 대장균군이 수질오염의 지표로 쓰이는 이유는 다음과 같다.
① 대장균은 수인성전염병과 함께 공존하여 수인성병원균의 존재를 판별할 수 있다.
② 다른 세균에 비해 검출이 용이하다.
③ 일반 세균보다 염소소독에 강하다. ( Virus > 대장균 > 일반세균 )
※ 그람양성박테리아와 그람음성박테리아의 구조
자료를 찾는 과정에서 그람양성박테리아와 그람음성박테리아의 구조를 나타내는 그림을 찾게 되었다. 그림을 보니 그람 염색과정이 이해하는데 한결 도움이 되었다.
※ 박테리아 밀도 측정 (발효관 시험의 정밀도)
만일 많은 수의 시료에 대해 조사가 이루어 지지 않는다면, 발효관 시험의 정밀도는 다소 낮다. 예를 들면, 시료가 1대장균/mL을 포함할 때 조차도, 1mL시험관에대한 약 37%가 음성값이 나올 것으로 추측될 수 있다. 왜냐하면 시료에서 박테리아가 임의로 분포되어 있기 때문이다. 각각 1mL의 시료를 가진 5개의 시험관이 이러한 조건하에서 사용되었을 때, 완전히 음성값이 그 때의 1%미만일 것으로 추측될 수 있다.
5개의 발효관이 사용되었을 때조차도, 실험값의 정밀도는 높은 것은 아니다. 결과적으로, 각각 시료를 희석한 몇개의 시험관을 사용하여 얻은 대장균 값의 위생학적 의미를 해석할때 커다란 주의를 요한다. 주어진 시료 채취위치에서 나오는 시료의 수가 한정되었을 때에 특히 주의를 요한다.
※ 토마스식에 의한 MNP 계산법 ※
단 하나의 MPN값을 가지고 일련의 시료에서 나온 결과 값을 요약하도록 요구될 때 geometirc mean이나 median방법을 이용한다.
최확수계산표는 가장 유사한 양성 시험관 조합을 보이고 있다. 만일 일치하지 않는 조합이 1%이상 빈번하게 나타나면, 그것은 방법이 틀리거나 MPN측정에서 통계적인 추정이 충족되지 않는다는 표시이다. 표에 나타나지 않은 조합, 또 다른 시험관 또는 희석액의 조합에 대한 MPN이 간단한 토마스 식에 의해 측정될 수 있다.
P : No. of positive tubes
N : mL sample in negative tubes
T : mL sample in total tubes
MPN표와 계산이 대장균 시험에 사용된 반면, 그것들은 적당한 시험 배지를 이용한다면 어떤 다른 미생물의 MPN을 결정하는데 똑같이 적용될 수 있다.
EX) 5-5-5법
희석배수
반응한 시료수
5
4
0
에서
P : No. of positive tubes
N : mL sample in negative tubes
T : mL sample in total tubes
T = 0.00555
(5개의 1/103에서 0.005 + 5개의 1/104에서 0.0005 + 5개의 1/105에서 0.00005)
N = 0.00015
T(1개의 1/104에서 0.0001 + 5개의 1/105에서 0.00005)
P = 9
(1/103에서 양성관수 5개 + 1/104에서 양성관수 4개)

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