Chromosomal DNA isolation of E.coli(대장균) Gene manipulation using PCR

소개글

Chromosomal DNA isolation of E.coli(대장균) Gene manipulation using PCR에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1.Introduction
☀ DNA, RNA 분리
☀ Plasmid DNA의 분리 및 정제방법
☀ Polymerase Chain Reaction 개요

2. PCR 단계
☀ PCR에 필요한 시약

3. Primer
☀ PCR을 이용하여 DNA 변형시키기

4. Chromosomal DNA isolation of E.coli
☀ Polymerase Chain Reaction

5. Results

본문내용

sample을 0.5 ml PCR tube에 준비한다.
- 각 tube에 PCR program[94℃ 2분, (94℃ 30초, 55℃30초, 72℃ 30초: 5 cycle), (94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초 : 20 cycle), 72℃ 5분]에 의한 PCR을 진행한다.
- 전기영동으로 결과를 확인한다.
Results
↑ Chromosomal DNA isolation of E.coli
↓ Polymerase Chain Reaction
Discussion
Chromosomal DNA isolation of E.coli
- 우선, 하루동안 배양한 E.coli의 세포를 깨기 위해 centrifugation을 시행하고, detergent인 NaCl과 EDTA를 첨가하였다. 우리가 실험한 chromosomal DNA는 크기가 크기 때문에, vortex과정에서 조심해야 했다. 60℃에서 10분동안 방치한 뒤, 첨가한 NaClO4는 단백질을 변성시킴으로서 활성을 없애는 역할을 하고, 그 후 첨가한 chloroform용액은 유기 용매로서 단백질을 제거하는 역할을 한 것 같다. 또, sup을 새 tube로 옮긴 후 95%의 EtOH 1㎖을 첨가하는 과정에서 우리 조는 실수로 70%의 EtOH를 1㎖넣었다. 이 때문에 centrifugation한 후 tube에 남아있는 하얀색 물질, 즉 E.coli chromosomal DNA의 양이 다른 조에 비해 상당히 적었고, 다른 조와 다르게 tube의 옆 벽에 붙어 있었는데, 이는 질량이 크지 않아 tube의 바닥에 침전되는 대신 일어난 결과로 보여진다.
- 총 100㎕중 5㎕를 1%의 agarose gel에서 HindⅢ marker와 함께 loading하였다. (단, result에 포함되어 있는 HindⅢ marker는 0.7%의 agarose gel에서 running한 것이기 때문에 우리가 실험한 gel 사진에 비해 분리가 잘되어있는 모습을 보인다.) 양에는 차이가 있지만 모든 조가 대체적으로 15kb부근에서 band가 형성되었으며 아래로 끌린 진한 band는 RNA라고 한다. 우리 조의 band는 화요일에 실험한 다른 조에 비해 그 색이 연하고 두께도 얇은 것을 볼 수 있다. 이는 실험과정에서 95%의 EtOH 1㎖ 대신 70%의 EtOH를 1㎖ 넣은 실수 때문에 gel running을 시행한 E.coli chromosomal DNA의 양이 다른 조보다 많이 적었기 때문이라고 추정된다.
Polymerase Chain Reaction
- 한 tube에 20㎕씩, 두 개의 tube를 만들기 위해, method에 제시한 PCR mix는 각각 2.5배한 양의 material을 이용하였다. 그 과정의 온도의 변화가 큰 Polymerase Chain Reaction을 시행하기 위해 높은 온도에서도 변하지 않는 thermo-stable한 taq. polymerase를 사용하였다.
- 1.8% agarose gel에서 총 20㎕중 5㎕를 HinfⅠmarker와 함께 loading하였다. 우리 조는 두 번의 gel running 결과, 한 개의 band만 249bp부근에서 나타났다. 똑같이 mix한 뒤 두 개로 나눈 tube의 실험결과가 다른 것에 따른 원인으로 여러 가지를 생각해 보았다. 우선 두 개로 나눌 때, PCR에 필수적으로 필요한 template나 primer, polymerase, dNTP가 불균형하게 배분되었을 가능성을 생각해 보았다. 그러나 이 경우, 아주 옅게라도 band가 나와야 정상일 것이므로, 두 번째 가능한 원인으로 taq. polymerase의 변성을 생각했다. 이 효소를 첨가한 뒤에는 tube를 반드시 ice에 보관해야 하는데, tube를 옮기고 다른 material들을 첨가하는 과정에서 우리도 모르게 한 tube에만 손과의 마찰 등을 통해 열을 가하게 된 것이 아닌가 추정된다. 또, primer에 문제가 있을 경우, template에 annealing되지 않으면, 증폭도 힘들기 때문에 한가지 원인으로 primer이상을 의심할 수도 있다. 이 외에, gel running 과정에서 일어날 수 있는 실수 때문에 아예 band가 나타나지 않았을 가능성도 있다.
- 다른 조를 보면, band가 여러 개 나타난 모습도 볼 수 있다. 이는 PCR mix를 준비하는 과정에서 template외에 다른 종류의 DNA가 섞였거나, 변형된 primer가 template 중간에 annealing되는 등의 이유로 다양한 size의 product가 만들어진 것이리라 추정된다. 또, 화요일 실험한 조가 나타낸 모든 band가 수요일 실험 조보다 옅게 나타났는데, 이는 조교언니가 준비해두신 material들의 농도가 다르기 때문이었을 것이라 생각했다.
Reference
참고서적
- Michael T.Madigan, John M.Martinko, Jack Parker / Brock Biology of Microorganisms / Prentice Hall / 10th edition / 2001
- Hugh G. Griffin, Annete M. Griffin / PCR technology - Current Innovations / CRC Press / 1994
- Kary B. Mullis, Francois Ferre, Richard A. Gibbs / The Polymerase Chain Reaction / Birkhauser / 1994
인터넷 자료
- http://kbiotec.kijeon.ac.kr/pro_master/BT2_8.hwp
- http://home.kyungwon.ac.kr/gene/
- http://www.kjcp.co.kr/note/lecture%20note/mole/molecular%20note/mole-8.htm
- http://www.khmc.or.kr/
- http://www.kjcp.co.kr/note/lecture%20note/molsil-korean/molsil-note/11-PCR.htm
- http://100.naver.com/100.php?where=100&id=125818

키워드

PCR,   대장균,   DNA,   RNA,   E.coli