생화학 gene clonig에 대한 전반적인 결과 보고서

소개글

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목차

1. 실험제목

2. 실험목적

3. 이름 & 조

4. 실험과정

5. 실험결과

6. 토의 및 고찰

본문내용

다. 이 과정 역시 세게 흔들면 안 되는데 chromosomal DNA가 나오게 되면 앞으로의 과정에서 플라스미드와 따로 분리해 낼 방법이 없기 때문이다. buffer3를 넣어 pH를 7로 복구가 되면 크기가 작고 supercoiled form을 유지하고 있던 플라스미드는 비교적 renaturation이 잘 되지만, chromosomal DNA는 미쳐 renature되지 못하고 엉기게 된다. 이렇게 엉긴 chromosomal DNA를 원심분리하게 되면 밑으로 가라앉게 되고, 상층액에는 플라스미드 DNA가 있게 되는 것이다. 원심분리를 한 용액을 상층액만 떠내어 새 튜브에 옮긴다. 밑에 가라앉은 것을 cell debris이므로 같이 빨려 오는 것을 피해야 한다. 그 다음에 상층액을 collection tuber가 장착된 spin column에 옮긴 후 전기 영동하는 것은 수용액에 있는 플라스미드만을 column위에 남기기 위함이다. 플라스미드가 수용성이여서 원심분리만으로는 가라앉지 않기 때문에 이와 같은 방법을 써준다. 마지막으로 buffer5를 넣어줌으로써 pellet을 녹이면 miniprep 단계가 끝난다.
이제 miniprep을 하였으니 전기영동을 해서 정제한 플라스미드 DNA를 확인해야한다. tube에 bromophenol을 넣고 well에 잘 로딩하고 버퍼를 넣어준 후 전압을 가해 분리를 일으킨다. well을 로딩하는 쪽은 (+)전하 쪽으로 해주어야 하는데 왜냐하면 전압을 걸어주면 인산기가 (-)전하를 띠기 때문에 (+)전하 쪽으로 밴드가 이동하기 때문이다. 그리고 로딩할 때 로딩버퍼를 함께 넣어주었는데, 로딩버퍼에는 분자량이 큰 글리세롤 등 무거울 물질이 함유되어 있어서 DNA가 든 시료를 gel 속에 잘 가라앉히고, 또한 파란색을 내는 bromophenol blue가 들어있어서 전기영동을 하는 동안에 시료의 이동정도를 가시적으로 볼 수 있게 해준다. 그런데 분리가 일어난 결과를 보니, 밴드의 끌림 현상이 나타났다. 밴드의 끌림 현상은 보통 단백질 로딩양이 많거나 stacking gel 부위가 짧은 경우, 또는 전기 영동시 온도가 과도하게 올라간 경우에 일어날 수 있다. 끌림 현상은 핵산 등 high charge, high molecular mass를 갖는 물질들에 의해 일어날 수 있다. 끌림 현상이 안 일어나게 하려면 잘 정제된 단백질을 사용하고, 로딩 하는 시료의 양을 줄이는 방법이 있다.

키워드

배지,   medium ,   PCR,   제한효소,   ligation,   transformation,   mini prep,   전기영동