논문번역 The Crystal Structure of Nucleoplasmin-Core

본문내용

되어 있었고 가열 단계는 생략됐다는 것을 제외하고는 유사하다. 개구리 난모세포로부터의 Np는 Sealy와 그의 동료들에 의한 논문에 따라서 추출되었고 위에서처럼 정제되었다.
4개의 core histone은 다음에 따르는 개선과 함께 닭의 적혈구로부터 정제되었다. Heparin이 micrococc al nuclease의 소화전에 NP40-washed nuclei의 비응축을 돕기 위해서 부가되었다. dimer와 tetramer의 혼합물은 hydroxyapatite 칼럼으로부터 2M NaCl과 pH 5나 6의 50 mM 인산 완충액과 함께 흘려보냄으로써 획득되었다. histone은 60% ammonium sulfate로 침전에 의해서 농축되었다. 그리고 풍부한 dimer와 tetramer의 파편들은 Superose 12HR 칼럼을 사용하여 크로마토그래피 분리법으로 획득되었다.
Proteolysis, Crystallization, and Structure Dertermination
끝이 잘려진 Np의 N-terminal 영역은 Proteolysis에 의해서 만들어졌다. 재조합 Np는 37°C에서 1시간동안 4mM Tris와 17mM NaCl 안에서 chymotrypsin에 의해서 소화되었다. 이 때 온도는 30분 후에 60°C까지 증가했다. 그리고 그 반응은 5mM PMSF와 함께 끝이 났다. 결과물인 Np-core는 25mM Tris와 100mM NaCl로 평형화 된 Superose 12HR 칼럼으로 정제되었다. 그리고 결정화를 위해서 20mg/ml까지 농축되었다. N-terminal sequencing과 mass spectrometry는 자연적 Np-core는 Lys10-Tyr124로부터 확장된다고 지적했다. Se-Met Np-core는 8개의 부가적인 N-terminal 잔기들을 보유하고 있다.
결정들은 0.1 M HEPES, 0.2 M MgCl2, 5% PEG-400 그리고 22~27% 2-propanol에서 방울들이 떨어짐으로써 점점 커졌다. 모액은 cryo 보호물질로서 20% ethlene glycol과 함께 단계적으로 보충되었다. 그리고 결정들은 액화 질소 속에서 살짝 얼려졌다. Native와 Se-Met MAD dataset들이 NSLS의 beamline*12C에서 모아졌다. HKL 프로그램 장비들과 함께 진전되었다. SOLVE는 Se-Met MAD dataset에서 10개의 Se 부위를 확인하고 정제하려고 사용되어졌었다. 5-접힘 대칭 Se 자리들 중 2 부분을 관찰함으로써 용액의 유효성을 확인했었다. 그리고 5-접힘 NCS operator들을 컴퓨터 계산하기 위해서 사용되어졌었다. MAD phase와 λ2 dataset이 평평화, NCS 5-접힘 평균 그리고 DM에서 히스토그램 매치를 포함하는 밀도 개선에 종속되는 전자 밀도 지도를 계산하기 위해서 사용되어졌다. 결과로 나타난 지도는 주 연결이 Se-Met88과 Se-Met91에서 시작되는 것을 추적하는 것이 가능하도록 했다. 그 모델은 X-PLOR에서 정제하는 동안에 5-접힘이 제한되었다. 이후의 단계에서, CNS는 대량의 용액을 모으거나 target의 최대화에 사용되어졌었다. Np-core pentamer는 native dataset에 대해서 굳어진 물질의 정제에 사용되어졌었다. 그리고 해상도가 2.3 A까지 확대되었다. 결정들의 싸여짐과 관련이 있는 pentamer의 영역이 CNS 제한물질 없이 정제되었다. CNS 안에 자동적으로 물을 제거하는 특징은 경계 부근에 물이 위치하도록 만들었다. 그리고 이것들은 5-접힘 제한물질들과 함께 정제되지 않았다. pentamer 모델의 기하학은 PRO CHECK와 함께 점검되었다. 그리고 모든 잔기들은 Ramachandran 지도에서 허락된 영역에서 발견되었다. 게다가 모든 monomer들에서 사라진 잔기들은 Lys10-Val15, Val34-Cys41 그리고 Ala119-Tyr124를 포함하고 있었다. 그리고 Gln68 -Glu73 사이의 잔기들은 β hairpin 없이 다양하게 정렬되었었다.
Ribbon의 상들은 SETOR를 사용하여 만들어졌다. 표면의 전극의 분배가 MOLMOL과 함께 시각화되었다. 그리고 다른 분자들의 상들도 Pdb Viewer로 획득되어졌다.
Reconstitution of Np Histone Complexes and Molecular Weight Analysis
Np와 histone을 포함하고 있는 복합체들은 1 M Nacl과 함께 10mg/ml로 섞음으로써 재분산되었다. 그 혼합물은 1 ml G-25 Sephadex spin 칼럼으로 염이 제거되었고 25 mM Tris-HCl과 100 mM NaCl로 His가 붙어있는 Np149가 없는 상태에서 평형화되었다. 그것은 100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl과 함께 수행되어졌었다. 복합체들은 25 mM Tris-HCl과 100 mM NaCl로 평형화 된 Suprose 12HR 칼럼에서 정제되었다. 크기 배제 크로마토그래프는 Suprose 12HR 칼럼에서 수행되었고 알려진 분자의 표준물질을 사용하여 검량되었다. 다양한 구성성분들의 평균 분자량은 Beckman 분석용 원심분리기에서 표준방법을 사용하여 결정되어졌다.
Acknowledgements
우리는 Np의 부클론화에 대해서 M. Goedert에게, Np149 클론을 제공한 것에 대해 D. Gorlich에게, Np 149의 정제에 대해서 D. Acehan에게, core histone 정제에 대한 충고에 대해서 M. Rout에게 감사한다. 우리는 또한 BUSM의 mass spectrophotometry facility의 임직원들과 NSLS의 beamline*12C 임직원들에게 도 그들의 도움에 대해서 감사를 표한다. S.D.는 그녀의 논문 연구에 대한 지지로 BUSM로부터 GSRF 상의 수상자였다. 이 연구는 National Institute of Health에 의해서 후원되었다. pentamer를 위한 조정들은 Protein Data Bank에 제출되었다. decamer에 대한 추가적은 조정은 요구에 의해서 이용될 수 있다.

키워드

Crystal,   Structure,   Nucleoplasmin,   Core,   nucleosome,   histone,   chaperone,   Np-core