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목차
16.1 안내
16.2 예비 요구사항
16.3 검출
16.4 Separation 분리
16.5 시료 준비
16.6 Solid-phase extraction
16.7 추출순서
16.8 Liquid/liquid extraction
16.9 정량화
16.10 검증
16.11 보조적인 작업
16.12 결론
16.2 예비 요구사항
16.3 검출
16.4 Separation 분리
16.5 시료 준비
16.6 Solid-phase extraction
16.7 추출순서
16.8 Liquid/liquid extraction
16.9 정량화
16.10 검증
16.11 보조적인 작업
16.12 결론
본문내용
(LLOQ에서는 20퍼센트 이하까지 허용됨)
16.11 보조적인 작업(support work)
16.11.1 matrix subtitution
분석을 위한 샘플들은 대부분은 plasma에서 얻어진다. 그러나 다른 matrix들(serum, 사람, 설치류의 혈액, 소변, 해부동물의 이)등에서도 쓰인다.
그러나 사람, 설치류, 영장류, 갯과(dog를 말함!) 의 혈청, 전혈, 뇨 같은 matrix 또한 source로 사용된다. 따라서 toxicokinetic(독성동력학?)과 대사의 윤곽 연구를 위해 분석시험에서 다양한 matrix의 효과를 비교하는 것이 필요하다. 개개의 치료면적을 위해 새로운 화학물질이 유도된다. 따라서 phase 2에서 중요한 질병상태에 있는 환자의 sample이 분석을 위해 존재할 것이다. 따라서 질병상태에 있는 환자는 대사가 다르고, sample 구성, 투여된 약물이 다르기 때문에 목적하는 혈장을 평가하는 것이 필요하다. 이 모든 것은 분석시험의 성취에 영향을 준다.
분석시료와 non-homologous internal standard의 회수율의 상대적인 차이는 matrix 마다 다를 것이고, 따라서 농도에 대한 peak height ratio 회귀분석 그래프도 다를 것이라는 사실을 알아야 한다. 이러한 경우에 회귀분석 그래프에 첨가시키려고 하기보다는 다시 재검증을 하는 것이 필요하다. 만약 대치된 matrix가 분석시료나 internal standard에 대해 받아들일 수 없는 방해(interference)를 보이거나 다양한 회수율을 보인다면 재검증을 위해 분석크로마토그래피나 추출이 필요하다.
16.11.2 stability
Freeze-thaw cycle
sample의 안정성에 영향을 주는 요인 중 하나는 냉동과 해동과정이다. 따라서 sample이 다시 재냉동 되고, 재분석 될 때 농도가 변하지 않아야 한다.
stability on storage
이것은 calibration line의 낮은, 중간의, 높은 지점의 생체 matrix에서의 bulk standard 를 준비함으로써 평가된다. 시료를 등분해서 반은 일정시간동안 각각 냉동한 후 해동하여 재분석하여 fresh standard와 비교한다. 나머지 반은 4℃에서 일정시간동안 저장한 후 재분석하여 fresh standard와 비교한다.
stability of extracts
분석은 종종 bulk에서 추출된 시료로 행해진다. run 후에 얻어진 최종 sample은 autosampler에서 밤새도록 보관되고, 기계에 문제가 생기는 경우 일주일동안 보관되기도 한다. 따라서 이 시료 추출의 안정성을 결정할 필요가 있다. 이것을 위해 calibration standard의 range의 양 끝을 internal standard로 준비하고 추출, 복제(duplicate), 분석한다. 그런 후 모든 추출물을 재분석하고 개개의 peak 높이와 peak height ratio를 처음의 분석 결과와 비교한다. 이 결과를 통해 추출물의 적합한 저장시간을 알 수 있다.
16.11.3 대사 산물
개발 중인 많은 혼합물은 불순물, 분해 산물, 그리고 대사산물을 포함하고 있다. 이것을 분석체의 정량 과정에서 분리해 내는 것이 꼭 필요하다. 이것들이 순수한 상태로서 이용 가능하다면 우선 그것들의 검출력을 측정해야 한다. 만약 이것들이 분석 환경 아래서 detector 반응을 유발하지 않는다면 어떠한 간섭도 일으키지 않을 것이다. 하지만, 분석체가 구조적 해석을 위해 수집된다면, 분석체의 peak는 최대한 깨끗해야 한다. 만약 분석체 관련 물질이 chromatogram에서 감지된다면, 분석체 peak(R>1.5)에 아무런 간섭이 없다는 것을 확인하는 것이 중요하고, 이 조건이 만족되지 못한다면 추출과 분석 과정에서 크로마토그래피 최적화가 필요하다.
경우에 따라 이런 현상은 분석 과정에서 분석체 관련 물질이 전혀 없는 곳에서 나타나기도 하지만 이것은 확실한 샘플의 분석에서 대사산물로서 나타난다. 이러한 경우에 크로마토그래피 상태는 시스템의 선택성을 증가시키기 위해 수정되어야 하고 이것이 성공적으로 증명되지 못한다면 추출도 바꾸어야 한다. 대부분의 대사산물, 특히 glucuronides와 sulphates이 모체보다 더 극성이라고 재진술하는 것은 의미 있는 일이며, 따라서 더 극성인 혼합물을 선택하기 위해 방법의 변화는 효과적이라고 증명될 것이다.
만약 모체뿐만 아니라 대사산물을 측정하는 것이 필요하다면 detector 선택, 크로마토그래피 분리와 추출과 같은 방법이 적용될 것이다. 하지만, 관련 혼합물의 다른 특성으로 인해 같은 시스템 내에서 이것들을 추출하거나 크로마토그래피 분석을 하는 것이 불가능할 수도 있다. 예를 들어 고체상에서 liquid/liquid extraction을 결합시키거나, ternary/quaternary elution을 사용하거나, 또, ion-pair method에서 reverse-phase system을 바꾸거나, 다른 detector를 사용하는 것이 필요할 수도 있다. 만약 LC-MS-MS가 사용 가능하다면, 이것은 선택의 기술이다. 이것이 불가능할 경우, column 교환이 어떤 환경에서의 어려움을 해결하는 적절한 방법일 수도 있다.
결국, 광범위한 대사의 결과물을 정량하기 위해 다른 조건 하에서 샘플을 쪼개거나 각각의 부분을 나누어 분석할 필요도 있다.
16.12 결론
이 방법의 개발 전략은 크로마토그래피 분석의 발달에 있어서 취해질 수 있는 주요한 단계들의 명확한 윤곽을 제시한다. 이것은 개별적 회사의 절차뿐만 아니라, 혼합물, 분석, 분석 요구의 특성에 의존하여 변화와 적용이 적절할 때의 명확한 자료를 위해 의도된 것은 아니다. 이 단원은 원리가 광범위하게 응용할 수 있지만 HPLC를 사용할 때 주요한 분석적 절차이기 때문에 우선적으로 다뤘다.
이 단원은 그 자체로도 의미를 가지지만, 이것이 전체 내용의 한 부분으로 생각될 때 유용성이 최대화될 것이다. 이것을 인식한다면, 이 단원은 많은 잠재적 함정을 피하고 분석적 발전에의 효율적이고 구조적 접근을 촉진하는 것을 도울 것이다.
16.11 보조적인 작업(support work)
16.11.1 matrix subtitution
분석을 위한 샘플들은 대부분은 plasma에서 얻어진다. 그러나 다른 matrix들(serum, 사람, 설치류의 혈액, 소변, 해부동물의 이)등에서도 쓰인다.
그러나 사람, 설치류, 영장류, 갯과(dog를 말함!) 의 혈청, 전혈, 뇨 같은 matrix 또한 source로 사용된다. 따라서 toxicokinetic(독성동력학?)과 대사의 윤곽 연구를 위해 분석시험에서 다양한 matrix의 효과를 비교하는 것이 필요하다. 개개의 치료면적을 위해 새로운 화학물질이 유도된다. 따라서 phase 2에서 중요한 질병상태에 있는 환자의 sample이 분석을 위해 존재할 것이다. 따라서 질병상태에 있는 환자는 대사가 다르고, sample 구성, 투여된 약물이 다르기 때문에 목적하는 혈장을 평가하는 것이 필요하다. 이 모든 것은 분석시험의 성취에 영향을 준다.
분석시료와 non-homologous internal standard의 회수율의 상대적인 차이는 matrix 마다 다를 것이고, 따라서 농도에 대한 peak height ratio 회귀분석 그래프도 다를 것이라는 사실을 알아야 한다. 이러한 경우에 회귀분석 그래프에 첨가시키려고 하기보다는 다시 재검증을 하는 것이 필요하다. 만약 대치된 matrix가 분석시료나 internal standard에 대해 받아들일 수 없는 방해(interference)를 보이거나 다양한 회수율을 보인다면 재검증을 위해 분석크로마토그래피나 추출이 필요하다.
16.11.2 stability
Freeze-thaw cycle
sample의 안정성에 영향을 주는 요인 중 하나는 냉동과 해동과정이다. 따라서 sample이 다시 재냉동 되고, 재분석 될 때 농도가 변하지 않아야 한다.
stability on storage
이것은 calibration line의 낮은, 중간의, 높은 지점의 생체 matrix에서의 bulk standard 를 준비함으로써 평가된다. 시료를 등분해서 반은 일정시간동안 각각 냉동한 후 해동하여 재분석하여 fresh standard와 비교한다. 나머지 반은 4℃에서 일정시간동안 저장한 후 재분석하여 fresh standard와 비교한다.
stability of extracts
분석은 종종 bulk에서 추출된 시료로 행해진다. run 후에 얻어진 최종 sample은 autosampler에서 밤새도록 보관되고, 기계에 문제가 생기는 경우 일주일동안 보관되기도 한다. 따라서 이 시료 추출의 안정성을 결정할 필요가 있다. 이것을 위해 calibration standard의 range의 양 끝을 internal standard로 준비하고 추출, 복제(duplicate), 분석한다. 그런 후 모든 추출물을 재분석하고 개개의 peak 높이와 peak height ratio를 처음의 분석 결과와 비교한다. 이 결과를 통해 추출물의 적합한 저장시간을 알 수 있다.
16.11.3 대사 산물
개발 중인 많은 혼합물은 불순물, 분해 산물, 그리고 대사산물을 포함하고 있다. 이것을 분석체의 정량 과정에서 분리해 내는 것이 꼭 필요하다. 이것들이 순수한 상태로서 이용 가능하다면 우선 그것들의 검출력을 측정해야 한다. 만약 이것들이 분석 환경 아래서 detector 반응을 유발하지 않는다면 어떠한 간섭도 일으키지 않을 것이다. 하지만, 분석체가 구조적 해석을 위해 수집된다면, 분석체의 peak는 최대한 깨끗해야 한다. 만약 분석체 관련 물질이 chromatogram에서 감지된다면, 분석체 peak(R>1.5)에 아무런 간섭이 없다는 것을 확인하는 것이 중요하고, 이 조건이 만족되지 못한다면 추출과 분석 과정에서 크로마토그래피 최적화가 필요하다.
경우에 따라 이런 현상은 분석 과정에서 분석체 관련 물질이 전혀 없는 곳에서 나타나기도 하지만 이것은 확실한 샘플의 분석에서 대사산물로서 나타난다. 이러한 경우에 크로마토그래피 상태는 시스템의 선택성을 증가시키기 위해 수정되어야 하고 이것이 성공적으로 증명되지 못한다면 추출도 바꾸어야 한다. 대부분의 대사산물, 특히 glucuronides와 sulphates이 모체보다 더 극성이라고 재진술하는 것은 의미 있는 일이며, 따라서 더 극성인 혼합물을 선택하기 위해 방법의 변화는 효과적이라고 증명될 것이다.
만약 모체뿐만 아니라 대사산물을 측정하는 것이 필요하다면 detector 선택, 크로마토그래피 분리와 추출과 같은 방법이 적용될 것이다. 하지만, 관련 혼합물의 다른 특성으로 인해 같은 시스템 내에서 이것들을 추출하거나 크로마토그래피 분석을 하는 것이 불가능할 수도 있다. 예를 들어 고체상에서 liquid/liquid extraction을 결합시키거나, ternary/quaternary elution을 사용하거나, 또, ion-pair method에서 reverse-phase system을 바꾸거나, 다른 detector를 사용하는 것이 필요할 수도 있다. 만약 LC-MS-MS가 사용 가능하다면, 이것은 선택의 기술이다. 이것이 불가능할 경우, column 교환이 어떤 환경에서의 어려움을 해결하는 적절한 방법일 수도 있다.
결국, 광범위한 대사의 결과물을 정량하기 위해 다른 조건 하에서 샘플을 쪼개거나 각각의 부분을 나누어 분석할 필요도 있다.
16.12 결론
이 방법의 개발 전략은 크로마토그래피 분석의 발달에 있어서 취해질 수 있는 주요한 단계들의 명확한 윤곽을 제시한다. 이것은 개별적 회사의 절차뿐만 아니라, 혼합물, 분석, 분석 요구의 특성에 의존하여 변화와 적용이 적절할 때의 명확한 자료를 위해 의도된 것은 아니다. 이 단원은 원리가 광범위하게 응용할 수 있지만 HPLC를 사용할 때 주요한 분석적 절차이기 때문에 우선적으로 다뤘다.
이 단원은 그 자체로도 의미를 가지지만, 이것이 전체 내용의 한 부분으로 생각될 때 유용성이 최대화될 것이다. 이것을 인식한다면, 이 단원은 많은 잠재적 함정을 피하고 분석적 발전에의 효율적이고 구조적 접근을 촉진하는 것을 도울 것이다.
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- 등록일2007.11.05
- 저작시기2007.9
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