크로마토그래피란?

소개글

크로마토그래피란?에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 개요

2. 종류와 원리
1). 종류와 분류
2). 원리
가). 기체 크로마토그래피
나). 액체 크로마토그래피
ㄱ). 원통관법
i). 흡착 크로마토그래피
ii). 분배 크로마토그래피
iii). 이온 교환 크로마토 그래피
iv). 젤 여과 크로마토그래피
v). 친화 크로마토그래피
vi). chromatofocusing
vii). 소수성 크로마토그래피
ㄴ). 판법
i). 얇은 막 크로마토그래피(TLC)
ii). 종이 크로마토그래피
다). High Performance (or pressure) Liquid Chromatography (HPLC)
라). Fast Protein Liquid Chromatography(FPLC)

본문내용

들고, 판 한 쪽 끝에 혼합 시료를 점적한 다음 적당한 전개 용매(이동상)가 들어있는 용기에서 전개시키면 흡착제 막의 모세관 현상에 의해 시료가 위로 이동된다. 이때 흡착제와 시료간의 흡착력 차이에 의해 이동 속도의 차이가 나게 되어 서로 분리된다.(그림 6) 분리된 시료의 위치는 적당한 시약으로 발색시키거나 UV lamp, I2 증기 등으로 확인하며 방사성 시료는 계수기로 확인하거나 주사기(scanner)로 정량 할 수도 있다. 전개 후에 시료의 이동거리를 용매의 이동 거리와 비교하여 Rf(Rate of flow) 값을 정한다.
시료의 이동거리
Rf = ────────
용매의 이동거리
이 값은 각 물질의 성질, 용매의 종류 및 온도, 흡착제 종류 등에 따라 다르다. TLC 방법은 아주 적은 양의 시료를(1 pg - 500 g) 신속하게 분리, 정성적으로 확인할 수 있다는 장점을 가지고 있으며 주로 지질의 분석에 이용된다.
그림 5. 얇은 막 크로마토 그래피(TLC)
ii). 종이 크로마토그래피
이 방법은 1944년 Martin과 Synge가 실리카겔 대신에 거름종이를 사용하여 아미노산이 분리되는 것을 관찰함으로써 시작되었다. 얇은 막 크로마토그래피의 얇은 막 대신 거름종이를 써서 하는 분석 방법이지만 얇은 막 크로마토그래피가 주로 흡착 크로마토그래피인데 반해 종이 크로마토그래피는 원리상으로 분배 크로마토 그래피의 일종이다. 즉, 거름종이에 흡착된 물이 정지상이 되며 물과 잘 섞이지 않는 유기 용매는(전개 용매) 이동상 역할을 한다. 모세관 현상으로 시료가 전개 용매를 따라 위로 이동할 때 물과 전개 용매에 대한 용해도의 차이에 따라 서로 분리되게 된다. 따라서 물에 잘 섞이지 않는 유기 용매에 잘 녹는 성분 물질은 덜 녹는 성분보다 더 멀리 이동하게되고 Rf 값은 더 커진다.(그림 6)
그림 6. 종이 크로마토그래피
다). High Performance (or pressure) Liquid Chromatography (HPLC)
앞에서 이미 언급된 고전 액체 원통관 크로마토그래피에서는 정지상과 이동상에 대한 시료의 분배평형을 잘 이루게 하기 위해서 이동상의 흐름을 빠르게 할 수 없을 뿐만 아니라 원통관의 준비과정 등으로 시료 분석 과정에 많은 시간이 소모되며, 또한 재현성도 낮다. 이러한 단점을 보완하여 최근에 개발된 HPLC는 급속한 발달을 보이며 많이 이용되고 있는데 용매의 이동이나, 시료 주입, 결과 분석 등의 과정이 w전자동화된 고성능 분석기기이다.(그림 7) 정지상으로 아주 작은 입자(직경 10-50 m)를 사용하며, 이동상 용매를 높은 압력에서 빠르게 흘려주므로 극미량의 시료를 (pg - fg) 훨씬 빠른 시간 내에 아주 효과적으로 분리할 수 있게 되었다. 분리능과 재현성이 아주 뛰어난 이 기기는 고전적인 원통관 크로마토 그래피 방법(흡착, 분배, 이온교환, 젤 여과, 친화 크로마토그래피)들을 모두 사용할 수 있으며, 혼합 시료를 안전하고 신속, 정확하게 정성, 정량 분석할 수 있음은 물론 물질의 분리에도 널리 이용되고 있다. 표 4는 생화학 분야에서 많이 사용되고 있는 HPLC의 원통과 종류를 나타낸
그림 7. HPLC의 기본구성
것이다.
표4. HPLC의 분석 원리 및 원통관 종류
분석 원리
원통관의 상품명
이온교환
PROTEIN-PAK DEAE 5PW
PROTEIN-PAK SP 5PW
젤여과
PROTEIN-PAK 300sw
PROTEIN-PAK 125
소수결합
BONDAPAK C18
NOVA-PAK C18
라). Fast Protein Liquid Chromatography(FPLC)
FPLC는 단백질이나 펩타이드, 핵산 등의 생체 물질을 정제하거나 분석하기 위한 목적으로 개발된 액체 크로마토그래피 기기이다. FPLC가 저분자 물질의 분질의 분석이나 분리에 좋은 장점을 많이 가지고 있지만 단백질이나 핵산 등 친수성의 큰 생체분자 분석에는 적합하지가 않다는 것이 밝혀짐에 따라 이 단점을 극복하기 위하여 만들어진 장치가 FPLC이다. FPLC는 고전 액체 크로마토그래피에서 사용하던 sephadex나 cellulose 등 친수성 재질을 개량하여 개발한 superose나 monobead를 원통관의 충진물로 사용하는데, 이들은 기존의 물질들과 달리 어느 정도 높은 압렵에서도 견딜 수 있도록 만들어져 있어서 HPLC에서와 같이 빠른속도로 용매를 흘려 짧은 시간 내에 분석을 마칠 수 있다. 또한 분석 과정의 대부분이 자동화 되어, 분석 과정중 개입될 수 있는 실험자의 실수를 예방 할 수 있을 뿐만 아니라 분석 조건을 같이해주면 거의 같은 결과를 얻을 수 있으므로 같은 장치로부터 얻은 실험 결과를 서로 비교해 볼 수 있고 재현성도 좋은 장점이 있다. FPLC장치의 또 다른 특징은 분석 과정 중 일어날 수 있는 생체 물질의 변성을 방지하기 위해 시료 용매가 접촉하는 부위에 borosilicate 유리나 Teflon, 혹은 titanium 등의 특수 재료를 사용하고 있다는 점이다. 이것은 생체 물질의 분리에 종종 사용되는 높은 농도의 염이나 강산 강알칼리 등의 용매는 stainless steel을 재료로 사용하는 기존의 HPLC장치에 흘리면 펌프나 관이 부식되고 이로부터 중금속 등이 유출되어 분석을 그르칠 수 있다는 점을 보완한 것이다. 표 5는 FPLC를 이용하여 할 수 있는 분석 원리의 종류 및 흔히 사용되는 원통관 이름이다.
표5. FPLC의 분석 방법 및 원통관 종류
분석 원리
상품화된 원통관 명
이온 교환
Mono Q (strong anion)
Mono S (strong cation)
Mono P (weak anion)
젤 여과
Superose 6
Superose 12
Fast Desalting Column HR
친화 분석
HiTrap Protein A
HiTrap Protein G
HiTrap Heparin
소수 결합
Phenyl Superose
Alkyl Superose
참고 문헌 :
실험 생화학(대한생화학 · 분자생물학회)
Macroscale and Microscale Organic Experiment(D.C. Health and Company)

키워드

크로마토그래피,   chromatography,   chromato,   화학,   생화학,   그래피,   graphy,   크로마토