[생화학 실험보고서] SDS-PAGE & Bradford Assay

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본문내용

cine이 자신의 pI 값에 따라 (+) charge 또는 중성을 띄므로(pH 6.8) Glycinate < X (protein) < Cl-의 이동속도를 보이게 된다. 따라서 Glycinate와 Cl-사이에 전기장이 생겨 Glycine의 속도가 빨라지게 되므로 사이의 X protein을 압축시키는 효과를 나타낸다[생체물리 책을 참고하였는데도 불구하고 왜 glycine과 Cl-사이에 추가적인 전기장이 걸리는지에 대한 이론적 배경은 잘 모르겠다. 전기장이 걸리면 전류를 일정하게 유지시켜주기 위해 두 molecule 사이에 추가적인 전압이 걸려 속도가 빨라진다는 이론이었는데 물리적 지식을 더 알아야 이해할 수 있을 것 같다.] 때문에 X protein이 stacking gel과 loading gel의 경계면까지 diffused되지 않고 sharp한 band를 그릴 수 있게 된다. Loading gel (pH 8.8)에서는 Glycine이 (-) charge를 띄므로, X (protein) < Glycinate < Cl-의 속도가 되어 이 때부터는 protein이 size에 따라 분리될 수 있다.
5) Bromophenol blue는 sample loading을 도우며 실험자가 electrophoresis rate를 눈으로 확인할 수 있도록 도와준다. Dye가 gel의 끝까지 내려가면 걸어준 전압을 off시키면 실험을 효율적으로 수행할 수 있다.
6) Bradford assay의 결과 BSA를 이용하여 standard curve를 얻어냈다. BSA의 농도에 따라 정확한 linear curve를 그리진 않지만 R2 >0.95이므로 대체적으로 신뢰할 수 있는 결과라고 할 수 있다. 미지의 sample을 측정하고 얻어진 흡광도를 y값으로 하여 x 값을 구했다(#1, #2 각각 x 값 = 16.5, 28.7). 이 값은 넣어준 sample의 양에 비례하기 때문에 각각 5, 10으로 나누어 주어야 정확한 농도를 구할 수 있다. #1에서는 3.30, #2에서는 2.87이 나왔으므로 sample의 농도 평균 = 3.09 (mg / ml)이라고 할 수 있다. 같은 sample임에도 농도 차이가 약 0.5 (mg / ml)정도 발생하였는데, 이는 BSA를 이용하여 standard curve를 그렸을 때의 실험적 오차, 미지의 sample을 preparation할 때의 오차로 해석할 수 있다. Bradford method가 0.001 mg / ml까지도 정량해낼 수 있으므로 실험에 보다 더 숙련되면 오차가 줄어들 것으로 예상된다.
6) Standard curve를 구할 때, BSA의 농도를 x 축으로 하지 않고 넣어준 BSA의 부피를 x 축으로 지정하였는데 그 이유는 BSA의 농도를 x 축으로 했을 때는 추가적으로 20을 곱하는 step을 거쳐야 하기 때문이다. 20을 곱해야 하는 이유는 standard를 넣은 양인 20 ㎕를 고려해야 하기 때문이다.
6. 참고문헌
1) 생화학실험(2) 실험교본, 교육과학기술부의생명특성화사업단.
2) 생화학실험(1) 실험교본, 교육과학기술부의생명특성화사업단.
3) Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer. 2007, Biochemistry, sixth ed.
4) http://en.wikipedia.org/wiki/
7. 추가문제
1) Protein quantification
- Lowry (copper and Folin-Ciocalteau phenol)
Lowry method는 널리 쓰이는 방법 중 하나로 알칼리 조건에서 구리이온이 peptide bond에 결합하는 Biuret method에 기초를 둔다. 생성된 Cu2+가 inorganic salt mixture인 Folin reagent와 Folin-Ciocalteu 반응을 하는데, phosphomolybdotungstate가 구리에 의한 aromatic amino acid의 산화에 의해 heteropolymolybdenum blue로 환원되는 반응에 의해 진한 푸른색을 발색한다. 이 방법은 0.01 mg / ml 정도의 양까지 감지할 수 있을 정도로 민감하고 단백질이 침전되어 있더라도 측정할 수 있다. 그러나 이 방법은 단백질의 종류에 따라서 그 값이 변할 수 있고 Folin-Ciocalteu 반응을 방해하는 물질들이 많기 때문에 단백질 용액에 그러한 물질들이 있는 경우 제거를 하거나 보정을 해 주어야 한다. Lowry method를 방해하는 물질에는 detergent, urea, guanidine HCl, 고농도의 sucrose, ammonium sulfate, 0.1 M 이상의 Tris-HCl, 1 M 이상의 sodium acetate나 sodium phosphate, EDTA, reducing agent 등이 있다.
- Bicinchoninic acid method
Bicinchoninic acid method (BCA method)는 protein solution에 Cu2+ ion가 반응하면 Bicinchoninic acid가 Cu2+ ion과 복합체를 형성하여 자색으로 발색하는 반응을 이용한 정량법이다. Protein의 종류에 따른 발색정도의 차이가 적고, detergent의 영향이 적다는 장점이 있으나 반응이 느리고 단백질이 변성된다는 단점 또한 존재한다.
- Biuret method
Biuret method는 알칼리 조건하에서 Cu2+ ion이 단백질의 peptide nitrogen에 결합하여 540 ~ 560 nm에서 흡광을 하는 보라색을 나타낸다. 이 반응은 구리가 peptide nitrogen에 결합하므로 단백질의 amino acid의 조성과는 관계없이 일정하나 ksqorwlf의 양이 1 mg / ml 정도가 되어야 하므로 sensitivity가 낮다는 단점이 있다.
- Bradford method (Coomassie brilliant blue G-250)
Bradford method는 Biuret method, Lowry method의 단점을 보완한 단백질 정량법이다. Coomassie brilliant blue dye가 단백질의 Trp,

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