분자생물학 실험보고서

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목차

1. Title: MINIPREPARATION을 위한 시약 만들기

2. Title: 제한효소(EcoR 1, Nco1)를 이용한 DNA 절편 절단과 전기영동

3. Title: 순수한 DNA plasmid 추출(minipreparation)

4. Recovery of DNA from Agarose gels

본문내용

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3. sample키를 누르고 삐소리나면 넣고 다시삐거리면 빼내어 수치를 읽는다.
4. abs : AU(흡광도) RNA/DNA : ㎍/㎖(DNA양, 농도)를 알수 있다.
* 빛이 들어가는 부분에 손을 대면 안되고 각 시료를 잴 때마다 증류수로 3~4번 세척
figure legends:
전기 영동 결과 DNA 덩어리를 확인할수 없었으며, 실험 조교의 재실험으로 위와 같은 DNA덩어리가 나와야 함을 확인 할수 있었다.
DATE:2004.10.28
4. Recovery of DNA from Agarose gels
summary:
DNA를 제한효소로 절단한 뒤 전기영동을 통해 DNA를 분리해서 우리가 원하는 DNA를 추출 하고자 한다. 이 추출된 DNA는 전기영동을 통해 재확인될 수 있다.
Introduction:
이 실험에서 사용되는 주로 사용되는 방법은 제한효소를 이용한 DNA분리법과 전기영동법이다.
제한효소와 전기영동법 ==>2번실험 discussion 참조
Material:
-1% agarose TAE 100㎖만들려면
1g agarose + 1X TAE buffer 100㎖
-10X TAE buffer
48.4g Tris base + 11.42㎖ glacial acetic acid + 20㎖ 0.5M EDTA(pH 8.0)
넣고 증류수로 100㎖맞춘다
-1X TAE buffer
10㎖ 10X TAE buffer + 90㎖ 증류수
* Enzymatic Digestion
Sample 23㎕
SalⅠ 2㎕
EcoRⅠ 2㎕
H Buffer 3㎕
Incubator 1hr at 37℃
e-tube, Micro pipet
* Eletrophoresis
1％ Agarose TAE - Agarose 2g, TAE 200㎖, 전자레인지, 저울
1Ⅹ TAE Buffer
EtBr, 용기, 알루미늄 박, shaking할 때 쓰는 기계, DNA gel, DW, DNA gel,
* 전기영동기계 - 보충
* Gel extract
사진촬영기기,e-tube, 2㎖ collection tube, Rack,
Voltex, Centrifuge, 1.5㎖ Microcentrifuge tube, MinElute column, Spin column,
QG Buffer(620㎕), Isopropanol(40㎕), PE Buffer(750㎕), EB Buffer(10㎕)
Experimental procedures:
* Enzymatic Digestion
1) e-tube에 Micropipet을 이용하여 Sample 23㎕에 SalⅠ 2㎕, EcoRⅠ 2㎕,
H Buffer 3㎕을 넣고 잘 섞었다.
2) 여러 가지 시약과 섞인 Sample을 Incubator에 37℃ 1시간 배양하여 증폭시켰다.
* Eletrophoresis
1) 1％ Agarose TAE를 만들기 위해 Agarose 2g과 TAE 200㎖을 시약용기에 넣고 Magnetic bar와 함께 교반기로 돌린 다음 더 잘 녹이기 위해 전자렌지에 10분에서 15분간 돌렸다.
2) 다 녹은 1％ Agarose TAE를 약간 식힌 다음 전기영동기계에 부었다.
3) 1％ Agarose TAE가 굳은 것을 확인하고 고정된 판을 뗀 다음 1Ⅹ TAE Buffer를 전기영동기계에 부었다.
4) 콤에 의해 만들어진 홈 속으로 loding dye가 섞인 Sample을 Micropippet으로 뽑아서 넣었다.
5) 전압을 걸어 band가 이동하는 것을 확인했다.
6) band가 다 만들어졌으면 전압을 끄고 사용하고자 하는 DNA band를 확인하고 band가 정상적으로 나타났다면 우리는 그 band의 DNA를 추출하면 된다.
* Gel extract(영어해석내용)
1) 암실의 UV가 쬐여진 사진촬영기기 위에서 깨끗한 칼로 Agarose gel로부터 DNA gel 조각을 잘랐다.
2) 잘려진 DNA gel 조각을 e-tube에 넣고, gel무게를 잰 다음 gel 부피 3배의 QG Buffer(120㎕)를 첨가했다.
3) 완벽하게 gel이 녹을 때까지 10분 동안 50℃ Incubate한다. 여기서 gel이 녹는 것을 돕기 위해 Incubator에 있는 동안 매 2-3분 Votexing 했다.
4) gel이 완벽하게 녹은 후, 섞인 용액이 노란색임을 확인했다.
5) Sample에 Isopropanol을 gel부피(40㎕) 만큼 넣고, 몇 번 정도 inverting 했다.
6) 2㎖ tube에 MinElute column을 넣고 적당한 rack에 보관했다.
7) DNA결합을 위해 MinElute column에 sample을 넣고 1분 동안 centrifuge했다.
8) Column에서 통과한 것은 버리고, 동일한 tube에 MinElute column을 넣었다.
9) Spin column에 QG Buffer를 500㎖ 첨가하고 1분 동안 centrifuge했다.
10) Column에서 통과한 것은 버리고, 동일한 tube에 MinElute column을 넣었다.
11) 세척을 위해, MinElute column에 PE Buffer 750㎖을 첨가하고, 1분 동안 centrifuge 했다.
12) Colum에서 통과한 것은 버리고, 추가적으로 1분 동안 MinElute column을 centrifuge했다.
13) 1.5㎖ Microcentrifuge tube 새 것에 MinElute column을 넣었다.
14) DNA를 뽑아내기 위해 EB Buffer 20㎕를 첨가하거나 여과지 막의 중심에 H₂O를 첨 가하고, 1분간 Column을 세워놓고, 그 때 1분 동안 centrifuge했다.
Result:
전기영동 결과 2027의 크기에 가까운 DNA 절편을 확인 할수 있었다.
Discussion:
전기영동 사진을 보면 사이즈 마크와 비교한 결과 2027과 가까운 절편만이 관찰되었다.
사진에 나타난 DNA의 크기를 알수 있다.
첫 번째 전기영동에서 아래의 그림과 같은 전기영동결과가 나왔었다.
두 번째 전기영동 결과 나타난 2027과 근접해 있는 DNA 절편은 1974bp의 우리가 얻어내고자 했던 DNA 절편임을 알수 있다.
Referance:

키워드

MINIPREPARATION,   제한효소,   EcoR 1,   Nco1,   순수한 DNA plasmid,   Agarose gels,   DNA,   전기영동