단백질 분리 및 정제 기술에 대해서 (정제의 목적과 준비, 단백질의 분리, 단백질의 정제)

소개글

단백질 분리 및 정제 기술에 대해서 (정제의 목적과 준비, 단백질의 분리, 단백질의 정제)에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 서 론……………………………-2-
　◆ 정제의 목적
　◆ 정제의 준비
　　1.특정 생물학적 발현에 관련 있는 단백질의 유무 확인
　　2.단백질 검정방법의 선택

2. 단백질의 분리……………………………-4-
　◆ Ammonium sulfate
　◆ MWCO
　◆ Dialysis

3. 단백질의 정제……………………………-5-
　◆ Chromatography
　◆ LPLC
　◆ HPLC · FPLC
　◆ Affinity chromatography
　◆ Ion-exchange chromatography
　◆ Gel filtration
　◆ 역상 chromatography
　◆ 소수성 chromatography
　◆ Electrophoresis
　◆ 등전점 electrophoresis
　◆ SDS-PAGE, 2D-PAGE

4. 참고문헌(Reference)……………………………-10-

본문내용

지지체에 결합시켜, DMP(dimethylpimelimidate)로 가교를 형성한다. 이 column에 항원 단백질을 특이적으로 결합시킨 후 산성 용액으로 용출한다.
그리고, Glutathione column에 의한 GST 융합 단백질의 affinity chromatography는 GST(glutathione S transferase) 융합 단백질에 사용하며, 원리는 GST 융합 단백질이 GST의 기질인 glutathione에 특이적으로 결합한다. column에 결합한 GST 융합 단백질을 10~20 mM glutathione으로 용출한다.
마지막으로, 단백질별 특이적 affinity chromatography는 2개 이상의 단백질에 대하여 친화성을 가지는 다양한 물질이 ligand로서 사용되고 있다. affinity chromatography로서 분리능력은 낮지만, ion-exchange법 및 gel filtration법과는 다른 분리 원리를 갖고 많은 단백질의 정제, 특히 정제 초기 단계에서 효과를 발휘한다.
Ion-exchange chromatography
Ion-exchange chromatography는 모든 단백질에서 사용 가능하며, 원리는 단백질은 산성 단백질에서 염기성 단백질까지 광범위하게 분포한다. 산성단백질은 음이온 resin에, 염기성 단백질은 양이온 resin에 전하 정도에 따라 다른 강도로 정전기적 결합을 한다. 단백질을 결합시킨 column에 서서히 염 농도를 증가시켜 단백질을 용출한다. 특징은 대표적인 chromatography로 단백질의 처리능 및 분리능이 모두 높아 저압 chromatography의 초기 정제 및 중고압 chromatography에 의한 최종단계의 정제에 적용되고 있다.
Gel filtration
Gel filtration 역시 모든 단백질에서 사용이 가능하며, 원리는 분자 size의 차이를 이용한 분리로 망상구조를 가지는 resin(gel)의 분자체효과에 의해 저분자는 resion 내부까지 침투하여 천천히 이동하는 반면 고분자는 resin 입자 사이를 빠르게 이동한다. 특징으로는 ion-exchange chromatography에 비해 시료의 처리능이 낮다. HPLC · FPLC 용의 경질 resin(gel)은 높은 분리능을 가지지만 단백질을 흡착하는 경향이 있고 연질 resin(gel)는 분리능이 약간 떨어진다. 경질 resin은 정제 후반, 연질 resin은 정제 초기단계에 유효하다.
역상 chromatography
역상 chromatography는 변성조건 하에서 단백질을 분리하는 경우 최종단계의 HPLC로써 사용하며, 특히 peptide와 작은 단백질에 효과적이다. 원리는 butyl기(), octyl기(), octadecyl(), phenyl기 중의 소수기를 가진 지지체에 산성조건(보통 0.05~0.1% TFA)에서 단백질 및 peptide를 결합시킨 후 acetonitrile의 농도 구배로 용출한다. 특징은 peptide 및 작은 단백질에 대하여 높은 분리능을 보인다. 분자량이 수만인 단백질의 경우 와 column을 사용하나 큰 단백질은 흡착 효율이 떨어져 손실이 많다. 한편, 용출된 단백질을 그대로 동결건조 할 수 있는 장점이 있다.
소수성 chromatography
소수성 chromatography는 미변성 조건에서 단백질을 분리할 수 있다. ion-exchange, gel filtration chromatography 등으로 충분히 정제할 수 없는 경우 정제 초기 또는 중기에 유효하며, ammonium sulfate 침전 및 이온교환 다음의 단계에 사용하기 쉽다. 원리는 소수성 차이를 이용하여 분리한다. phenyl기, octyl기(), pentyl기(), butyl기() 중 소수기를 가진 resin에 고농도의 염의 존재하에서 단백질을 결합시킨 후 염농도의 하강 농도구배로 용출한다. 특징으로는 중성조건하에서 역상 chromatography이며, 고염농도에서 단백질의 소수적 상호작용이 증가하는 것을 이용한다. 평형화 buffer의 염 농도는 목적 단백질이 염석되는 농도보다 조금 낮아진다.
Electrophoresis
고분리능을 가지는 전기영동법으로 단백질을 정제할 수 있는 수단으로 이용가능하다.
등전점 electrophoresis
등전점 electrophoresis는 등전점의 차에 의하여 분리한다. 대부분의 가용성 단백질에 유효하고, 비변성조건 하에서 mg order로 그 이상의 단백질을 분리할 수 있다. 원리는 특수한 양성 전해질(양성 지지체)을 이용해서 전체 극간에 pH의 구배를 형성시키는 방법과 양성 지지체를 막에 고정화해 고정화 pH 구배를 형성시키는 방법이 있다. 단백질은 자신의 등전점과 일치하는 장소로 이동하여 영동을 정지한다. 특징으로는 분리능이 높은 전기영동법으로 단백질의 등전점을 결정할 수 있는 이점이 있다.
SDS PAGE, 2D-PAGE
SDS PAGE, 2D-PAGE는 아미노산 서열분석 및 항원 조제를 목적으로 변성된 단백질을 수 부터 수십 까지 하나의 단백질로 분리가 가능하다. 최종단계에 사용한다. 원리는 SDS-PAGE는 분자량의 차이에 따라, 2D-PAGE은 SDS PAGE를 수행하는 2D-PAGE로는 여러 가지 분자량과 등전점의 차에 따라 단백질을 고도로 분리한다. 특징은 구조해석의 경우는 단백질의 band를 gel 위에서 확인하는데 가장 정확하고 신속한 방법이다. 2D-PAGE의 경우는 추출액으로부터 다른 정제과정 없이 구조 해석용의 정제 단백질 회수가 가능하다.
4. 참고문헌(Reference)
TaKaRa, 『Refolding CA kit 실험강좌』,
네이버 지식백과
위키 백과사전
그림1] 주한승, 효소공학 수업자료, 2012
그림2] TaKaRa, 『Refolding CA kit 실험강좌』,
그림3] TaKaRa, 『Refolding CA kit 실험강좌』,
그림4] TaKaRa, 『Refolding CA kit 실험강좌』,
그림5] 주한승, 효소공학 수업자료, 2012
그림6] 주한승, 효소공학 수업자료, 2012
그림7] 주한승, 효소공학 수업자료, 2012

키워드

단백질 분리,   단백질 정제,   단백질,   Protein,   정제,   분리,   단백질공학,   HPLC,   Electrophoresis,   전기영동