DNA 농도 측정 및 플라스미드 (plasmid), 전기영동법 (gel electrophorosis)

소개글

DNA 농도 측정 및 플라스미드 (plasmid), 전기영동법 (gel electrophorosis)에 대한 보고서 자료입니다.

목차

(Plasmid DNA 분리
&
농도 측정
&
electrophorosis)

본문내용

영양 생화학 실험
실험일: 학번: 이름:
제출일: 실험조:
1. 주제 Plasmid DNA 분리 & DNA 농도 측정 & DNA gel electrophorosis
2.
재료
및

기구 기구 1) Plasmid DNA 분리
centrifuge, e.p tube, column(max 750ul), conical tube, pipette, vortex, collecting tube
2) DNA 농도 측정
UV-Vis Spectrophotometer, Cuvette, pipette, e.p tube, TE 완충용액
3) DNA electrophoresis
Mini gel running kit, UV illuminator, vortex, TAE(tris-acetate) buffer
Microwave oven, pipette, vortex, elderlyflask(삼각플라스크), electrophoresis tank, comb, cuvette, parafilm,
시약 1) Plasmid DNA 분리
E.coli sample, Resuspension buffer, RNase A solution, lysis buffer, Neutralization buffer, washing buffer B, Elution buffer
2) DNA 농도 측정
3) DNA electrophoresis
Plamid DNA sample, 50X TAE(tris-acetate-EDTA) buffer – tris base 242g, acetate acid 57.1ml, 0.5M EDTA 100ml, DW 1ml, Elution buffer, agarose 0.5g, 1kb DNA ladder(size marker),DNA loading dye (bromophenol blue, xylene cyanol FF, Glycerol), EtBr, UV
3.
실험 목적

및
원리 목적 형질전환 된 E.coli의 cell로부터 plasmid DNA를 분리하고, 분광광도계를 이용하여 DNA의 농도와 순도를 분석한다. 또 agarose gel 상에서 electrophoresis 하여 목적하는 DNA의 크기를 분석할 수 있다.
원리
1) Plasmid DNA 분리 (이온 교환 크로마토 그래피)

형질전환 된 E.Coli cell로부터 plasmid DNA를 재분리 하고자 하는 실험으로서, plasmid preparation method에는 alkali lysis법, boiling법, 효소 분해법 등이 있다.
형질 전환 균주가 갖고 있는 플라스미드에 존재하는 내성유전자에 상응하는 항생물질이 들어간 선택배지에서 균주를 배양하면, 플라즈미드를 갖고 있는 형질전환 균주는 항생물질이 존재하는 배지에서 살아남는다. 이 형질전환 균주를 액체 배지상에서 적당한 세포수로 배양한 후 회수해 플라스 미드를 얻는다. 세포를 끓이거나, 알칼리 상태에 둘 경우 세포가 용해되면서 세포 내에 존재하는 플라스미드가 세포 밖 수용액상에 나오게 된다. 이것을 원심분리를 통해 세포 잔여물을 제거하면 플라스미드가 다량 녹아 있는 수용액을 얻을 수 있다. 이 수용액에 에틸알코올이나 이소프로필 알코올을 처리하면 DNA가 침전되며 침전된 DNA를 적당한 완충용액에 녹임으로써 플라스미드 DNA를 정제할 수 있다.
혹은 이온 교환 크로마토 그래피 법을 이용하여 보다 순수한 plasmid DNA를 정제할 수도 있다.

2) DNA 농도 측정
분광흡광계(spectrophiotometer)를 이용하여 DNA 농도와 순도를 분석할 수 있다.
핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 등은 자외선(260nm)을 강하게 흡수하는데, 이것은 퓨린 및 피리미딘 염기의 공명구조 때문이다. 개개의 염기들은 각기 특성저자외선 흡수 스펙트럼을 가지며 핵산의 총 흡광도는 핵산을 구성하는 염기들의 총 흡광도의 합과 같다고 생각할 수 있기 때문에 260nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도를 산출한다. 한편 단백질이 강하게 흡수하는 280nm에서의 흡광도를 측정하여 A260/A280의 비를 계산함으로써 단백질에 의한 오염상태를 추정할 수 있다.

3) DNA electrophorosis
분리한 plasmid DNA를 agarose gel에서 전기를 걸어 분리하면 크기를 비교 분석 할 수 있다.
전기이동은 전기장이 걸린 한천겔(agarose gel)에서 DNA가 크기에 따라 분리되도록 하는 실험 방법이다. 전기 이동된 DNA는 ethidium bromide로 염색함으로써 눈으로 확인할 수 있고 그 밝기로 농도를 추정할 수 있다. 농도를 정략적으로 측정하기 위해서는 농도를 알고 있는 DNA를 대조구로써 함께 전기 이동한 후 겔의 사진을 찍고 band의 밀도를 densitometer로 읽는다. 대조구 DNA의 농도와 측정된 밀도 사이의 표준곡선을, 그리고 샘플 band의 밀도에 해당되는 DNA 농도를 내삽(intapolation)으로 얻기도 한다.

키워드

플라스미드,   DNA농도,   DNA측정,   영양 생화학 실험,   Report