LB배지를 이용한 배양_Liquid culture & Expression_예비레포트 [A+]

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LB배지를 이용한 배양_Liquid culture & Expression_예비레포트 [A+]에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 실험 목적
2. 바탕 이론
3. 기구 및 시약
4. 실험 방법
5. 참고 문헌

본문내용

배를 받는 유전자군으로, 전사단위 중 하나이다. 또한 효소합성에 관련된 DNA로, DNA 전사를 조절하는 일련의 유전자군이다. 대부분 원핵생물에만 존재하며, Lac 오페론이 활성화되면 젖당 대사에 필요한 효소들이 동시에 만들어진다. 따라서 오페론은 일종의 스위치 역할을 한다고 할 수 있다. 오페론의 조절 유전자에서 생산되는 억제물질이 작동유전자에 달라붙어 전사가 일어나지 않게 한다. 따라서 유도물질(Inducer)을 추가해 억제 단백질(Repressor)에 결합시켜 Repressor가 전사를 방해하지 않도록 해야 한다. 그러면 RNA 중합효소에 의해 전사가 시작될 수 있다.
Fig 6. 오페론의 구조
3. 기구 및 시약
① Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG) (1000X)
② Ampicillin (1000X)
Fig 7. IPTG
- Lac operon에 의해 조절되는 단백질의 발현을 위해 락토오스 대신 넣어주는 유전물질이다. 알로락토오스(allolactose)는 β-galactosidase에 의해 분해되는데 IPTG는 분해되지 않기 때문에 Lac Operon을 이용한 단백질의 발현에 이용된다. 이는 Lac operon의 Repressor에 결합해 Lac operon 뒷부분의 유전자를 유전자 전사를 가능하게 한다.
Fig 8. Ampicillin의 화학구조
- 반합성의 페니실린 항생제로, 아미노페니실린(aminopenicillin) 계통의 하나이다. 이는 세포질 막 안의 페니실린 결합 단백질과 결합해 박테리아의 세포벽에서 일어나는 최종 펩티드전이 단계를 방해해 펩티도글리칸의 합성과 세포벽의 형성을 방해한다.
③ Autoclave (고압멸균기)
④ Shaking incubator (진탕배양기)
Fig 9. Autoclave
- 멸균하기 위해 사용하는 장치로, 밀폐상태에서 121℃, 15psi의 고압증기를 사용한다.
Fig 10. Shaking incubator
- 미생물을 접종한 액체 배지를 흔들어 그 움직임으로 공기 중의 산소의 이동을 촉진시켜 배양하는 장치이다. 이번 실험에서는 호기성 균 및 세포의 배양을 위해 사용한다.
⑤ Flask
⑥ Cuvette
Fig 11. Flask
- 삼각형 모양으로 되어 있으며, 이번실험에서는 시약을 담아 진탕배양기에서 사용한다.
Fig 12. Cuvette
- 액체에 대한 빛의 흡수를 측정할 때 측정할 시료를 넣는 용기이다.
⑦ UV spectrophotometer (분광광도계)
⑧ UV transilluminator
Fig 13. 분광광도계
- 어떤 물질이 흡수하는 특정한 빛 에너지 스펙트럼을 측정하는 장치로, 이번 실험에서는 Optical Density 측정에 사용한다.
Fig 14. UV transilluminator
- Cell의 검출 목적 등에 이용되는 기기로, 특정 파장의 UV를 조사해 형광을 일으킨다.
⑨ LB배지 (Yeast extract, NaCl, Tryptone)
- 미생물의 성장에 필요한 여러 영양분을 포함하며, 각종 박테리아를 배양하는 데 사용되는 배지이다.
Fig 15. LB배지
LB 배지의 성분
역할
Yeast extract (효모 추출물)
0.5g
박테리아가 생장하기 위해 필요한 각종 영양소가 들어있는 효모에서 추출한 물질이다.
NaCl (염화나트륨)
1g
세포가 삼투에 의해 터지지 않게 해주며, 세균의 신호전달 체계에 필요한 이온을 공급해준다.
Tryptone
0.5g
박테리아의 성장에 필수적으로 필요한 아미노산을 공급해준다.
물
배지성분의 95%을 차지하며 증류수나 탈 염수를 사용한다.
Table 1. LB 배지의 성분
4. 실험 방법
LB배지 조성
100 ml 기준
Tryptone
1g
Yeast Extract
0.5g
NaCl
1g
(1) 위의 조성으로 50 ml LB배지 2개를 만든다.
(2) 만들어진 LB 배지를 Autoclave로 멸균한다. (※ Autoclave 사용 시 주의)
(3) 멸균된 LB 배지를 꺼내 clean-bench에서 60 ℃ 이하로 식힌 후, 두 플라스크에 Ampicillin (1000X)을 각각 50 μl씩 넣는다.
(※ Clean bench 사용 시 UV를 주시하지 않도록 주의한다.)
(4) eGFP DNA을 포함하는 미리 배양 된 세포 5 ml을 플라스크 하나에 넣은 후, shaking incubator에서 37 ℃로 배양한다.
(5) 대조군으로 미리 배양 된 세포(eGFP DNA 미포함) 5ml을 나머지 플라스크에 넣은 후, shaking incubator에서 37 ℃로 배양한다.
(6) 배양한 배지 1 ml을 sampling하여 600 nm파장대의 흡광도를 측정한다.
(7) O.D 값이 0.6~0.8사이가 되면, 각각의 플라스크에 IPTG (1000X)를 50 μl 넣어준다.
(8) 두 개의 플라스크를 25 ℃의 shaking incubator에서 induction한다.
(9) UV transilluminator를 통해 각각의 액체배지를 비교한다.
※ 실험 시 유의사항
- Autoclave 사용 시 고온 상태에서 실험하므로 폭발을 주의해야 한다.
- Autoclave로 멸균 시킨 뒤 압력과 온도가 충분히 떨어지고 나서 뚜껑을 열어주어야 한다.
- 배지가 오염되지 않도록 주의한다.
- Incubator (항온조) 사용 시 온도를 37℃로 일정하게 유지해야 한다.
- Cuvette 사용 시 겉 표면에 이물질이 묻지 않도록 주의해야 한다.
5. 참고 문헌
- Charles N. Satterfield, Heterogeneous Catalysis in Industrial Practice,” 2nd ed., McGraw-Hill, Inc. (1993).
- W Mantele, E Deniz, UV-VIS absorption spectroscopy: Lambert-Beer reloaded, Elsevier, 173 (2017), 965-968
- Reece 외 3명, ‘생명과학 개념과 현상의 이해, PEARSONEDUCATIONKOREA, (2011).

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