LB배지를 이용한 배양_Liquid culture & Expression_결과레포트 [A+]

소개글

LB배지를 이용한 배양_Liquid culture & Expression_결과레포트 [A+]에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Abstract
2. Experiment
3. Result
4. Discussion

본문내용

c operon system과 IPTG
- Lac operon(lactose operon)은 E.coli를 포함한 다른 대장균들의 젖당 대사에 관여하는 오페론이다. 이는 대장균 등의 세균에서 락토오스 (젖당 또는 유당)를 수송하고 대사하는데 필요한 3개의 단백질을 암호화하는 유전자들이 한 mRNA 의 형태로 발현되면서, 이 발현되는 양 또한 함께 조절되는 오페론이다. 세균이 오페론은 일반적으로 하나의 mRNA에 여러 가지의 유전자를 포함하도록 구성되기 때문에 동시에 여러 단백질이 같은 비율로 발현될 수 있다. 외부에 포도당이 없고 젖당만이 존재하는 경우에 이를 효과적으로 사용하기 위해 락 오페론에서는 3개의 유전자 S structure gene(lacZ, lacY, lacA)가 발현된다. lacZ는 이당류인 젖당을 포도당과 갈락토오스로 자르는 β-galactosidase를 발현하고, lacY는 세포막에서 양성자의 동력을 에너지원으로 이용해 젖당을 세포 안으로 수송하는 수송단백질을 암호화한다. 마지막으로 lacA는 β-galactoside transacetylase를 암호화한다.
이러한 S structure gene들의 발현은 lac Ⅰ에 의해 조절될 수 있다. 다음 Fig 13.의 발현 기작과 같이 lac Ⅰ에서 발현되는 억제 단백질은 젖당의 유무에 따라 활성이 달라진다. 먼저 배지에 젖당이 있는 경우, 젖당의 대사산물인 allolactose가 억제 단백질과 결합, 형태를 변화시켜 operator에 결합할 수 없게 만든다. 따라서 정상적으로 RNA polymerase가 결합할 수 있게 되어 S structure gene가 발현되어 단백질이 생성된다. 이와 반대로 배지에 젖당이 없는 경우에는 lacZ의 operator에 결합해 lacZ의 β-galactosidase 발현을 막는다.
Fig 14. Lac operon의 발현조절 기작
이번 실험에서 사용한 IPTG (1000X)는 젖당과 그 구조가 유사한 물질이기 때문에 젖당과 같은 매커니즘을 따라 억제 단백질과 결합한다. 따라서 downstream이 정상적으로 유전자를 발현할 수 있게 한다. 하지만 IPTG와 젖당의 다른 점은 젖당은 lacZ에서 발현되는 젖당 분해효소인 β-galactosidase에 의해 분해되지만 IPTG는 이것에 의해 분해되지 않기 때문에 계속적으로 단백질을 생산해 과도한 발현이 일어날 수 있다는 점이다.
※ Cell growth curve와 O.D.의 관계
- Cell growth curve (세포 생장 곡선)은 세포의 생장을 나타내는 곡선으로, 유도기(Lap phase)와 지수기(Exponential phase), 그리고 다음으로 정지기(Stationary phase)에 이어서 마지막으로 사멸기 (Death phase)로 구분된다.
① 유도기 : 처음 배양액에 세포를 접종했을 때 세포가 새로운 환경에 적응하며 천천히 증가하는 시기이며, 세포분열이 즉각적으로 일어나지 않고 질량도 일정하지만, 유도기 때 세포는 새로운 구성성분을 합성한다.
② 지수기 : 미생물의 성장이 가장 폭발적으로 증가하는 시기로 이 때의 OD값은 0.6~0.8를 나타낸다.
③ 정지기 : 세포를 닫힌계에서 계속 배양했을 때 집단의 생장이 멈추게 되어 생장곡선이 수평이 되는 때이다. 이 때 미생물의 생장이 종료되어 미생물의 총 수는 일정하게 유지된다.
④ 사멸기 : 오랜 정체기에 이어 영양물질의 고갈이나 독성노폐물의 축적 끝에 나타나는 미생물의 죽음으로 인한 세포 수의 감소 현상이다.
Fig 15. 세포 생장 곡선
지수형태로 세포의 생장이 폭발적으로 증가하는 단계인 지수기에서 OD값은 0.6~0.8를 나타내게 되는데, 이 때 IPTG를 넣어주면 eGFP 가 발현할 수 있는 최적의 조건이다. 만약 OD값이 0.4보다 작으면 E.coli가 생장하지 못하고 외래 DNA까지 발현하게 되어 중요한 세포의 생장에 에너지가 사용되지 않게 된다. 또한 OD값이 0.8보다 크면 세포가 과도하게 증식되어 세포가 원하는 수준으로 발현되기 어렵다.
※ 실험에서 Ampicillin을 60℃ 이하로 식힌 뒤 넣어주는 이유는?
- Autoclave에서 멸균을 할 때에는 약 121℃ 의 온도로 배지를 멸균하는데, 이렇게 배지의 온도가 너무 높으면 온도에 민감한 엠피실린의 활성이 떨어지게 된다. 이는 엠피실린이 온도에 민감한 β-lactam 고리를 가지기 때문이다. 따라서 적당한 온도인 60℃로 배지를 식힌 뒤 엠피실린을 넣어주어야 한다.

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