Plasmid DNA isolation from bacterial cell_Miniprep_예비레포트 [A+]

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목차

1. 실험 목적
2. 바탕 이론
3. 기구 및 시약
4. 실험 방법
5. 참고 문헌

본문내용

er, S2 buffer,
S3 buffer, PW buffer, EB buffer
⑤ Spin column & Collection tube
Fig 10. Spin column & Collection tube
- DNA를 신속하게 정제하기 위한 고체상 추출 방법 중 하나이다. Spin column과 Collection tube가 결합된 상태에서 원심분리할 시료와 buffer가 혼합된 용액을 spin column에 주입하면, 원심력에 의해서 원하는 물질이 spin column의 필터에 남고 나머지 용액과 buffer는 밖으로 유출되어 collection tube에 모이게 되는 원리를 이용한다.
⑥ Electrophoresis apparatus (전기영동장치)
⑦ Electrophoresis agarose
Fig 11. Electrophoresis apparatus
- 전기영동을 하는 기기로, DNA의 크기가 클수록 느리게 이동하게 되고, 전기장의 방향 또한 이동속도에 영향을 미친다.
Fig 12. Electrophoresis agarose
- Agarose Gel은 젤화 경향이 센 다당류의 하나로 생체 물질을 분리하는 여과제로 사용된다.
⑧ DNA ladder (= Size marker)
⑨ DNA loading star (6X)
Fig 13. DNA ladder
- 샘플의 크기를 알기 위한 기준으로 사용되는 시약으로, 첫번째 홈에 로딩하여 측정하고자 하는 DNA의 크기를 비교하는데 사용된다.
Fig 14. DNA loading star
- DNA와 결합해서 agarose gel 상에서 DNA의 위치를 파악하게 해주는 염색약이다. 파란색을 띠기 때문에 전기영동을 하는 동안 눈으로 확연하게 진행 상태를 확인할 수 있다.
⑩ UV transilluminator
⑪ TAE buffer (1X)
Fig 15. UV transilluminator
- TLC 또는 electrophoresis 실험에 있어서 cell의 검출 목적 등에 이용되며, 특정 파장의 UV를 조사하여 형광을 일으키므로 투명성과 UV intensity가 탁월하기 때문에 electrophoresis 실험 시 미량의 DNA도 검출할 수 있다.
FIg 16. TAE buffer
- Tris Acetate, EDTA Buffer이며 전기 영동시 DNA가 양극으로 이동할 때 운반체의 역할을 해준다. Tris는 양이온을 공급해 음전하를 띠는 DNA를 끌어주고, Acetate는 Tris의 높은 pH를 낮춰 DNA의 손상을 억제한다. 마지막으로 EDTA는 DNase의 마그네슘 이온을 억제해서 전기영동을 하는 동안 DNA가 변질되는 것을 방지한다.
※ 실험 시 유의사항
- 원심분리시킬 때 micro tube 끼리의 무게가 대칭이 되게 해야 한다.
- S1 Buffer는 중성 pH에 가깝기 때문에 사용하는 중에 오염될 위험이 있다. 따라서 저온에 보관해야 장기간 사용할 수 있기 때문에 냉장보관해야 한다.
- S2 Buffer를 넣고 inverting 한 뒤 반응시간이 5분을 넘지 않도록 해야 한다. 왜냐하면 S2 단계는 DNA 변성 단계이기 때문에 5분 이상 방치하면 용해가 더 진행되어버릴 수 있기 때문이다.
- 완충용액끼리 헷갈리지 않도록 유의하고, 피펫 팁은 용액을 바꿀 때마다 새로 끼워주어야 한다.
4. 실험 방법
(1) 미리 배양한 세포 1.0 ml을 1.5 ml micro tube에 넣는다.
(2) 15,000 rpm으로 10분 원심분리 한 뒤 상등액을 버린다. 이 때, 무게가 대칭되도록 해야 한다. 남은 상등액은 Micro pipette을 이용해 제거한다.
(3) Cell이 들어있는 tube에 S1 buffer를 250 μl 넣고 pipetting한다.
(4) S2 buffer를 250 μl 넣고 4회 inverting한다.
(※ 이 때, 반응시간이 5분을 초과하지 않도록 주의한다.)
(5) S3 buffer를 350 μl 넣고 4~ 6회 inverting 한다.
(6) 15,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하고 spin column과 collection tube를 준비한다.
(7) Spin column에 상등액을 붓는다.
(8) 15,000 rpm으로 1분 동안 원심분리하고 spin column으로 걸러진 collection tube의 solution은 버린다. (※ 이 때, collection tube는 버리지 않는다.)
(9) 다시 spin column을 꽂은 후 PW buffer를 750 μl 넣고 15,000 rpm으로 1분 원심분리 한다.
(10) 걸러진 collection tube의 solution은 버리고 다시 한 번 더 15,000rpm으로 1분 원심분리 한다.
(11) Spin column을 새로운 1.5 ml micro tube에 꽂은 다음 EB buffer를 50 μl 넣는다.
(12) 상온에서 1분 동안 방치한 뒤 15,000 rpm으로 1분 간 원심분리 하고 1.5 ml micro tube에 추출된 plasmid DNA는 -20 ℃에서 보관한다.
(13) 전기영동기기에 Agarose gel을 넣고 1X TAE buffer를 잠길 때까지 채운다.
(14) Agarose gel의 첫 번째 홈에 DNA ladder 10 μl를 loading한다.
(15) Loading star (6X) 2 μl를 새로운 microtube에 넣고 10 μl Plasmid DNA 추출 용액과 섞은 뒤 두 번째 홈에 loading한다.
(16) 100 V의 전압에서 1시간동안 전기영동을 한다.
(17) Agarose gel을 꺼내 UV transilluminator위에 놓고 자외선을 쬐어 Plasmid DNA의 크기를 확인 한다.
5. 참고 문헌
- https://cafe.naver.com/biofactacademy/76 (바이오팩트 공식 학술카페) - Plasmid prep
- [네이버 지식백과] 플라스미드 [Plasmid] (분자·세포생물학백과)
- 김명원 외 9명, 생명과학 개념과 현상의 이해, PEARSON, 186page, 210~212page

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