제한효소를 이용한 Restriction of DNA_예비레포트 [A+]

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제한효소를 이용한 Restriction of DNA_예비레포트 [A+]에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 실험 목적
2. 바탕 이론
3. 기구 및 시약
4. 실험 방법
5. 참고 문헌

본문내용

되어 심하면 gel이 녹거나 DNA의 구조가 변형될 수 있다.
3. 기구 및 시약
① Plasmid DNA
② PCR tube
Fig 7 . 박테리아의 구조와
플라스미드 DNA
- 플라스미드 (Plasmid) 는 생장에 필수적인 염색체 (Chromosome) DNA에서 물리적으로 분리되어 있으며 독자적으로 증식할 수 있는 작은 원형의 DNA 분자이다.
Fig 8. PCR tube
- PCR machine에 사용되는 아주 작은 크기의 0.2ml tube이다.
③ Micropipette 10μl
④ Incubator (항온기)
Fig 9. Micropipette
- 미량 분석에서 이용되는 미량 액체의 부피를 정확하게 채취, 배출시키기 위한 기기이다.
Fig 10. Incubator
- 세균을 배양하기 위한 목적으로 사용되며, 일정한 최적 온도를
유지해주는 기구이다.
⑤ 10x H buffer
⑥ Restriction Enzyme
(EcoR Ⅰ, Nde Ⅰ, Xho Ⅰ)
Fig 11 . H buffer
- Tris-HCl (pH 7.5) 500mM,
MgCl2 100mM, NaCl 1000mM,
DDT(Dithiothreitol) 10mM 로 구성되었으며, 제한효소의 활성을 최대화하기 위해 pH를 조절해주는 용액이다.
Fig 12. 제한효소의 기능
- 제한효소는 DNA의 특정한 염기의 배열을 식별하고, 이중 사슬을 절단하는 효소로, 이번 실험에서는 EcoR Ⅰ, Nde Ⅰ, Xho Ⅰ의 3가지 제한효소를 사용한다.
⑦ Electrophoresis apparatus (전기영동장치)
⑧ Electrophoresis agarose
Fig 13. Electrophoresis apparatus
- 전기영동을 하는 기기로, DNA의 크기가 클수록 느리게 이동하게 되고, 전기장의 방향 또한 이동속도에 영향을 미친다.
Fig 14. Electrophoresis agarose
- Agarose Gel은 젤화 경향이 센 다당류의 하나로 생체 물질을
분리하는 여과제로 사용된다.
⑧ 1 kdp DNA ladder
(= Size marker)
⑨ DNA loading star (6X)
Fig 15. DNA ladder
- 샘플의 크기를 알기 위한 기준으로 사용되는 시약으로, 첫번째 홈에 로딩하여 측정하고자 하는 DNA의 크기를 비교하는데 사용된다.
Fig 16. DNA loading star
- DNA와 결합해서 agarose gel 상에서 DNA의 위치를 파악하게 해주는 염색약이다. 파란색을 띠기 때문에 전기영동을 하는 동안 눈으로 확연하게 진행 상태를 확인할 수 있다.
⑩ UV transilluminator
⑪ TAE buffer (1X)
Fig 17. UV transilluminator
- TLC 또는 electrophoresis 실험에 있어서 cell의 검출 목적 등에 이용되며, 특정 파장의 UV를 조사하여 형광을 일으키므로 투명성과 UV intensity가 탁월하기 때문에 electrophoresis 실험 시 미량의 DNA도 검출할 수 있다.
FIg 18. TAE buffer
- Tris Acetate, EDTA Buffer이며 전기 영동시 DNA가 양극으로 이동할 때 운반체의 역할을 해준다. Tris는 양이온을 공급해 음전하를 띠는 DNA를 끌어주고, Acetate는 Tris의 높은 pH를 낮춰 DNA의 손상을 억제한다. 마지막으로 EDTA는 DNase의 마그네슘 이온을 억제해서 전기영동을 하는 동안 DNA가 변질되는 것을 방지한다.
※ 실험 시 유의사항
- 제한효소를 넣기 전에 반응액을 잘 섞어 첨가된 물질들이 골고루 섞이게 해야 한다.
- 제한효소는 비정상조건에서 활성화되는 것을 최소화하기 위해 가장 나중에 넣어준다.
- 전기영동장치에 전압을 건 뒤에 buffer에 손이 닿지 않게 유의해야 한다.
- Buffer를 너무 많이 채워넣으면 전기영동의 속도가 느려지기 때문에 주의해야 한다.
- 핵산 분해효소는 손이나 땀 등에도 있기 때문에 혼입을 막기 위해 장갑과 마스크를 반드시 착용해야 한다.
- 사용하는 tube와 피펫 팁, 용액 등은 멸균해 핵산 분해효소를 불활성시켜두어야 한다.
4. 실험 방법
(1) 아래와 같은 조성으로 반응 용액을 만든 후 10 μl pipette으로 섞어준다. 용액을 만들 때 표의 위에서 아래 순서대로 넣어주어야 한다. 3가지의 제한효소는 Xho Ⅰ → Nde Ⅰ → EcoR Ⅰ의 순서로 넣어준다.
DDW
8μl
DNA
7μl
10x H buffer
2μl
Enzyme
각 1μl
Total
20μl
Table 1. 반응 용액 만들기
(2) 37 ℃의 Incubator에서 1시간동안 반응시킨다.
(3) 전기영동기기에 Agarose gel을 넣고 TAE buffer (1X)를 gel이 잠길 때까지 채운다.
(4) Agarose gel의 첫 번째 홈에 DNA Ladder 10 μl를 loading한다.
(5) Loading star (6X) 2 μl와 반응한 DNA 10 μl를 섞은 뒤 두 번째 홈에 loading한다.
(6) 대조군으로 Loading star (6X) 2 μl와 반응하지 않은 DNA 10 μl를 섞은 뒤 세 번째 홈에 loading한다.
(7) 100 V의 전압에서 1 시간 동안 전기영동을 한다.
(8) Agarose gel을 꺼내 UV transilluminator 위에 놓고 자외선을 쬐어 restriction한 DNA와 restriction을 하지 않은 DNA를 비교한다.
5. 참고 문헌
- Polisky, B.; 외. “Specificity of substrate recognition by the EcoR I
restriction endonuclease” , PNAS 72 (9): 33103314.(1975).
- Watson, Molecular biology of the gene, Pearson Benjamin Cummings, Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
- [네이버 지식백과] 플라스미드 (분자,세포생물학백과)
제한효소 (두산백과)

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