유산균 Genomic DNA prep

소개글

유산균 Genomic DNA prep에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 실험 제목
2. 실험 목적
3. 이론 및 원리
(1) DNA
(2) 원심분리법(Centrifuge method)
4. 실험 방법
5. 실험기구 및 시약
(1) 실험 기구
(2) 시약
6. 참고문헌

본문내용

되도록 첨가하고 유리막대를 이용하여 조심스럽게 섞 는다.
3) 용해된 세포 용액을 50 수욕에서 간헐적으로 섞어 주면서 3시간 동안 반응시킨다.
4) 용액을 상온에서 식힌 뒤 tube로 옮기고 동량의 phenol : chloroform : isoamylalcohol (25:24:1) 을 첨가하고 뚜껑을 막은 뒤 조심스럽게 천천히 상온에서 10분간 수용액 층과 유기용매 층을 섞 는다.
5) 상온에서 5,000 xg로 15분간 원심분리하여 수용액 층과 유기용매 층을 분리한다.
Phenol은 pH8.0 인 Tris-Cl 용액으로 평형시킨 후 사용하여야 한다. 그것은 phenol의 pH가 8.0이면 유기용매 층과 수용액 층 사이에 DNA가 걸려 채취하기 곤란한 경우를 방지 해 주기 때문이다.
6) 수용액 층을 새 원심분리관으로 옮긴다.
DNA의 농도가 높으면 점도가 매우 크므로 조심해서 다루어야 한다. 즉 수용액 층을 옮길 때 DNA 용액을 천천히 빨아올려서 중간층의 물질이 따라 올라가지 않도록 해야한다. 중간층의 물질이 따라 올라가면 phenol : chloroform 추출을 다시 한번 시행해야 한다. 상층액을 뜨는 것 이 용이하지 않으면 긴 피펫을 이용해 하층액을 제거해도 좋다.
7) 단백질이 완전히 제거되었다고 생각할 때까지 phenol : chloroform 추출을 반복한다.
단백질이 제거되었는지의 여부는 흰색을 띠고 중간층에 모여진 물질이 있는지 없는지를 보아 서 결정한다.
8) 약 200kb 이상의 DNA를 분리하고자 할 경우에는 추출한 DNA 용액을 4 의 50mM Tris-Cl, pH8.0, 10mM EDTA 용액에서 투석을 실시한다. 투석된 50mM Tris-Cl, pH8.0, 10mM EDTA 용 액의 흡광도가 270㎚에서 0.05㎚이하가 될 때까지 계속한 후 pH8.0인 TE buffer 용액에서 4시간 이상 투석한다.
9) 약간의 기계적 손상을 감수할 경우에는 DNA 용액에 10M ammonium acetate 용액을 최종농도 2.5M이 되도록 첨가하고 4 에 보관되어 있는 2.5배 용량의 ethanol을 넣으면 즉시 DNA가 침전 된다.
10M ammonium acetate 대신 pH 5.5, 3M sodium acetate 0.1부피를 첨가해도 된다.
10) 실타래처럼 엉기는 물질이 염색체 DNA로 이것을 건져내어 ethanol이 날아갈 때까지 실온에 두어 말리거나 진공펌프를 연결하여 건조시킨다.
11) DNA를 건져낸 후 남은 용액은 12,000rpm으로 4 에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 완전히 제거하고 나면 DNA를 더 얻을 수 있다.
12) TE 완충용액을 적당량(5㎎) 첨가한 후 DNA가 충분히 녹을 때까지 4 에 보관했다가 분광광 도기로 정량한 다음 실험에 이용한다.
분광광도기로 260㎚와 280㎚에서 DNA 용액의 흡광도를 측정하였을 때 A260/A280의 값이 1.75 이상이 되어야 한다. 이보다 낮으면 단백질이 포함되어 있음을 의미하므로 phenol : chloroform 추출을 다시 시행하여야 한다.
260㎚에서 흡광도가 1일 때 double strand DNA는 50㎍/㎖, single strand DNA는 33㎍/㎖, RNA는 40㎍/㎖을 의미한다.
5. 실험기구 및 시약
1) 실험 기구
원심분리기, 피펫, 삼각플라스크, 유리막대, 수욕, 분광광도기
2) 시약
① Phosphate-buffered saline(PBS, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM sodium phosphate(dibasic), 1.4mM potassium phosphate (monobasic))
- NaCl 8g, KCl 0.27g, Na2HPO4 (dibasic) 1.15g, KH2PO4 (monobasic) 0.2g을 녹이고 증류수로 1L를 맞춘다.
② TE buffer(10mM Tris-Cl, pH 8.0, 1mM EDTA, 20㎍/㎖ pancreatic RNase A, 0.5% SDS)
- Citric acid 0.48g, sodium citrate 1.32g, glucose 1.47g을 증류수에 용해시켜 100㎖로 희석한다.
③ Proteinase K
- Proteinase K powder를 10mM Tris-Cl, pH 7.4, 10mM EDTA, 150mM NaCl, 0.4% SDS에 녹 인다. 증류수에 녹여 사용하여도 무방하다.
④ 10M ammonium acetate(또는 3M sodium acetate)
⑤ phenol
⑥ chloroform
⑦ isoamylalcohol
6. 참고문헌
Ⅰ. 서적
1) 대학미생물학(제 8판). M.T. Madigan, J.M. Martinko, J. Parker 저. 권오섭 외 39인 역. 탐구 당. 2000, p231, p232, p240, p410.
2) 분자생물학요설. David Freifelder 저. 祐成. 1989, pp211∼219.
3) 생화학. 생화학편찬위원회. 청문각. 1997, p137, p253, p254.
4) 생명과학(이론과 현상의 이해, 제3판), N.A.Campell 저, 김명원 외 15인 역. 2001, p205.
5) 신분자유전학. 카지이에이지 저. 정해영 역. 신일상사. 2001, pp20∼23, p211, p212.
6) 일반미생물학. L.M. Prescott, J.P. Harley, D.A. Klein 저. 김경민 외 6인 역. 라이프사이언스. 2003, pp208∼214.
7) 임상분자생물학. 이동호, 이승관, 김성욱. 펴냄 홍. 2000, pp131∼136.
8) 필수세포생물학. B. Alberts 외 6인 저. 박상대 외 33인 역. 교보문고. 2001, pp173∼179.
Ⅱ. 인터넷
1) http://100.naver.com/100.php?where=100&id=52655
2) http://100.daum.net/DIC/detail?id=1284850&sname=디엔에이&ty=1#0.2.0
3) http://opendic.naver.com/100/entry.php?entry_id=119939

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