방선균의 보존 및 배양

목차

1. 분석 목적
2. 분석 동향
3. 분석 원리
4. 분석 방법
5. 결론 및 전망

본문내용

alanine
p-Aminobenzoic
acid
Sulfonamide
Proline
3,4-Dehydroproline
Nicotonic acid
3-Acetylpyridine
Tryptophane
5-Methyltryptophane
6-Methyltryptophane
Pyridoxine
Isoniazid
Tyrosine
p-Fluorophenylalanine
Thiamine
Pyrithiamne
Threonine
β-Hydroxynorleucine
Arginine
Canavanine
Valine
α-Aminobutyric acid
Histidine
2-Thiazolalanine
1,2,4-Triazol-3-alanine
Isoleucine
그림 6. 유사물질에 내성을 갖는 돌연변이의 분리를 위한 구배평판법
항 대사물질을 첨가하는 경우에는 반드시 합성배지(synthetic medium)를 사용해야 한다. 복합배지(complex medium)에서는 항 대사산물에 의해 억제, 저해된 생합성 경로의 대사산물이 배지로부터 공급되기 때문이다.
영양요구주의 분리
Lederberg의 Replica 평판법을 사용한다. 변이주를 master배지로부터 replica를 이용하여 최소배지로 이식한 후 생장을 확인한다(그림 7.). 그러나 이 방법은 많은 양의 평판배지를 요구하므로 복잡하다. 따라서 먼저 원하는 영양요구주를 집적, 농축하는 방법이 개발되었다. 여과집적법은 돌연변이 유발후 생육하는 원영양체는 여과하여 제거하고, 성장이 안 일어나는 영양요구주 포자는 여액에 모으는 방법이다. penicillin 농축법은 최소배지에서 자라는 원영양균주만 사멸되고, 자랄 수 없는 영양요구주는 생존시켜 집적 배양하는 방법이다(그림 8). Sodium pentachlorophenolate는 발아하는 포자에 독성이 강한 특성을 이용하여 방선균에 이용하기도 한다.
그림 7. Replica법에 의한 영양요구주의 분리
그림 8. 페니실린 농축법에 의한 영양요구주 선별
Agar plug법에 의한 역가 시험
항생물질, 효소제, 효소저해제의 활성 측정은 감수성이 있는 미생물, 기질 또는 효소-기질이 함유된 배지에서 직접 활성도를 측정할 수 있다. 선별된 콜로니를 원통의 한천(agar cylinder)위에서 습윤 배양한 후에 평판배지로 옮긴다(그림 9.). 저해 또는 반응이 일어난 환의 직경을 측정함으로서 목적산물의 농도 또는 균주의 생산성을 확인할 수 있다. 그러나 Agar plug 방법의 문제점은 고체배양과 액체배양의 항생물질 생산성이 상관관계가 적다는 것이다. 따라서 개발 초기에는 효과가 있으나 고농도 공정에서는 생산성의 증가를 측정할 수 없다. Agar plug는 cork borer 또는 가는 유리관으로 찍어서 만들고, humid chamber는 아크릴로 제작하여 사용하면 간편하다.
방선균의 순화(adaptation)
인공돌연변이를 통하여 얻은 변이주는 불안정하기 때문에 2∼3회에 걸쳐 natural selection을 거쳐서 안정성을 확인, 확보하는 과정이 필요하다. 이를 순화작업이라고 한다. 또 한 번 UV로 인공돌연변이 유도를 행하였으면 natural selection을 통한 순화과정 후에 NTG 등 다른 기작의 돌연변이 유도원을 사용하여서 균의 퇴화를 막는다.
그림 9. Kasugamycin 균주 육종에 사용된 agar plug 방법
방선균의 배양시 사용되는 배지 조성
방선균을 배양하는 과정에서 목적 및 용도에 따라 복합배지와 합성배지가 필요하다. 여기서는 문헌에 보고된 것들에 대하여 비교 실험을 실시하여 효과가 좋은 배지 조성을 확립하였다.
복합배지는 방선균의 생장속도가 빠르고, 고농도의 균체 농도를 얻을 수 있으며, 균사체가 pellet을 형성하지 않고 잘 분산되어 자라는 것이어야 한다. 합성배지는 최소의 성분으로 정량적인 분석이 가능하여야 한다. 특히 pH 변화를 방지할 수 있어야 한다. 확립된 배지 조성은 표 4.와 같다.
표 4. 방선균 배양시 사용되는 복합배지 및 합성배지 조성
구 분
복 합 배 지
합 성 배 지
탄 소 원
Glucose 30g/ℓ
Malt extract 3g/ℓ
Glucose 20g/ℓ
질 소 원
Peptone 10g/ℓ
Yeast extract 10g/ℓ
Casein hydrolysate 3g/ℓ
NH4Cl 1g/ℓ
또는 Arginine 1g/ℓ
무 기 염 류
없음
MgSO4.7H2O 0.5g/ℓ
K2HPO4 3g/ℓ
미 량 원 소
없음
FeCl2, MnCl2, ZnCl2, CaCl2
CuCl2, CoCl2 각 1g을 0.1N -HCl 1ℓ에 녹인다.
배지조제시 1㎖/ℓ를 첨가
pH 조절
살균전 5N-NaOH로 pH7.5로 조절. 살균후 pH6.8∼ 7.0
MOPS(3-(N-Morpholino)-Propane-Sulfonic acid) 10g/ℓ를 첨가한 후, 5N-NaOH로 살균전 pH7.2로 조절
살 균 조 건
Glucose는 별도로 나누어 121℃, 15분 살균
Glucose는 별도로 나누어 121℃, 15분 살균
기 타
소포제는 약간 첨가
만약 growth factor가 필요한 경우에는 yeast extract 1g/ℓ를 첨가한다.
5. 결론 및 전망
균주의 보존 및 배양, 특히 육종에 관한 분석은 생리활성 물질 분석에 수반되는 과정이며, 생물공정의 한 공정을 차지하지만 체계적인 분석이 독창적으로 이루어지지는 못하는 실정이다. 분석 대상인 생리활성물질에 따라, 방선균 종류에 균주의 보존, 배양 등이 달라지므로 많은 분석 보고서의 분석방법중에 실린 내용을 수집, 정리하는 방법이 한가지 일 수는 있다. 그러나 대체로 분석 결과에서도 균주의 육종에 대한 것은 자세히 기술하지 않고, 기술 knowhow와 직결된다는 점 때문에 생략하는 경우가 많다. 따라서 방선균의 탐색, 분리와 함께 보존, 배양 및 개량에 대한 분석이 독자적으로 이루어져야 할 것이다. 방선균에 대한 균주 육종 분석이 방선균 관련 분석 개발 및 산업화의 기반이라는 점을 인식해야 할 것이다. 분류, 생화학, 유전, 생리 등의 분석도 방선균 보존 및 배양이 뒷받침되어야 정확하고, 효율적으로 이루어질 것이다.

키워드

방선균 보존,   방선균 배양,   미생물 보존,   단기 보존법,   장기 보존법,   초저온 냉동보존법,   모노콜로니 분리,   돌연변이 유도