일반 생물 레포트 - 박테리아 실험

목차

1. 박테리아의 형질전환
- 박테리아의 형질과정
- 플라스미드의 개념과 분류
- 박테리아에 외부유전자를 감염시키는 방법

2. 주변의 생물에서의 미생물의 분리
- serial dilution이란?
- 우리 주변의 미생물

3. 형질 전환된 대장균에서 플라스미드 분리
- LB배지(성분, 고체배지와 액체배지)
- Linear DNA와 supercoiled DNA의 특성
- Alkaline lysis method의 원리

4. 주변의 생물에서의 미생물의 분리
- Streaking을 하는 이유
- 멸균방법

5. 제한효소에 의한 플라스미드 절단
- 제한효소의 정의, 종류
- 제한효소와 리가아제의 활용
- DNA loading 염색액의 역할
- Et Br의 역할

6. 분리된 미생물의 관찰
- Gram staining

본문내용

화시켜서 자신의 제한효소가
자신의 DNA를 자를 수 없게 보호하고 있다.
(2) 제한효소의 종류
제한효소는 3가지로 나눌 수 있으며, 실험실에서 사용되는 것은 대부분 type II이다.
ㄱ. Type I restriction enzyme : DNA의 특정부위를 인식하긴 하지만 인식된 부위가 아닌 다른 부위를 절단한다. 즉, 인식부위는 특이성을 가지지만 그로부터 약 1,000 base pair가 떨어진 부위를 절단하기 때문에 원하는 부위를 선택하여 자르기가 어렵다. 따라서 이 효소들은 박테리아의 기능에는 중요하지만 실험목적으로는 잘 사용되지 않는다.
ㄴ. Type II restriction enzyme : 인식부위와 절단부위가 모두 특이성이 있는 제한효소이므로 분자생물학 연구에 아주 유용하게 이용되고 있다. 실험에 쓰이는 제한효소는 특별한 말이 없는 한 type II를 말한다. 대부분의 type II 제한효소는 4~6개의 염기서열을 인식하는데, 이에 따라 DNA 상에 인식부위가 나타나는 빈도가 달라지게 된다.
ㄷ. Type III restriction enzyme : 인식한 DNA 부위에서 어느 정도 떨어진 부위를 절단한다. 분자생물학 실험에는 잘 사용되지 않는다.
(3) Blunt end와 Sticky end
ㄱ. Sticky end : double strand DNA를 restriction enzyme(제한 효소)자르거나 또는 다른 이유로 두가닥 중 한 가닥이 더 길어서 삐져 나온 경우 상보적으로 삐져나온 가닥과 쉽게 결합할 수 있다. 이 경우를 sticky(끈끈한 : 쉽게 붙을 수 있다는 데서 유래한 것입니다.) end 라고 한다.
ㄴ. Blunt end : 삐져 나온 부분이 없는 경우 끝이 밋밋하다 하여 blunt end라고 한다. blunt end의 경우 상보적으로 붙을 수 있는 부분이 없기 때문에 ligation이 sticky end에 비해 훨씬 어렵다.
(4) 제한효소의 명명
- 우선 그 제한 효소를 분리한 세포의 속명의 첫 글자를 대문자로 쓴다. 그 뒤에 그 세포종명의 처음 두 자까지를 소문자로 쓴다. 그리고 제한효소를 분리한 세포가 특정한 균주명이 있는 경우에 그 strain명을 써준다. 또 세포가 몇 개의 다른 R-M (restriction-modification)system - 다른 인식부위, 다른 제한효소-를 가지고 있을때는 로마숫자로 그것을 표기해준다.
② 위의 실험을 통해서 제한효소에 대해 알게 되었다. 그런데 효소 중에는 리가아제라는 효소도 있다. 이 효소는 제한효소에 의해 절단된 부위를 다시 붙이는 것이다. 이 두 가지 효소를 어떻게 이용할 수 있을지 자세히 적어보자.
- 제한효소를 통해 DNA에서 원하는 부분을 잘라낼 수 있고, 리가아제를 통해 잘려나간 부분에 새로운 DNA를 접합시킬 수 있다. 이를 유전자 재조합에 이용할 수 있다. 유전자 재조합이란 어떤 생물에서 뽑아 낸 특정 DNA를 잘라 운반체 DNA에 삽입하여 재조합 DNA를 얻은 후 세균과 같은 생물체에 넣는 과정을 말한다. 예를 들어 사람의 DNA에서 인슐린 DNA를 제한효소로 자르고 대장균의 플라스미드도 같은 제한효소로 자른다. 그 플라스미드에 인슐린 DNA를 붙인다. 이때 리가아제란 효소를 사용한다. 대장균을 대량으로 키우고 거기서 인슐린만 뽑아서 사람이 사용한다. 이 기술은 각 생물이 지닌 종(種)의 차이라는 두꺼운 벽을 뛰어넘어 DNA의 재결합체를 만들 수 있게 하였기 때문에 분자생물학의 기초연구뿐만 아니라, 의학 ·농업 ·공업 등 광범위한 분야에 대하여 응용이 시도되고 있다. 이미 몇 가지 호르몬을 비롯한 인터페론 등 의약품을 세균이 만들도록 하는 데 성과를 거두었다.
③ DNA loading 염색액의 역할은 무엇인가?
- Agarose의 well에 DNA를 넣어줄 때 DNA 용액을 무겁게 하여 agarose의 well로 가라앉히는 역할을 하며 그 성분에 전기영동 되는 속도가 다른 두 개의 염색시약이 들어있어 DNA와 같이 전기 영동되며 DNA의 전기영동된 정도를 알 수 있게 한다. sucrose, glycerol, ficoll 등이 함유되어 있어 DNA가 든 시료를 gel 속에 잘 가라앉게 한다. 또, bromophenol blue(BPB : 파란색)과 xylene cyanol(XC)는 DNA를 염색시켜서 진행정도를 확인한다. (-)전하를 가지므로 전기영동시 DNA와 같은 방향으로 이동하게 된다.
④ Et Br는 어떤 역할을 하는가? 그 사실을 통해 Et Br가 강력한 발암인자인 이유를 생각해보자.
- Et Br(Ethidium Bromide)는 DNA 염기 사이로 끼어드는 평면구조를 가진 그룹을 지니고 있어서 부력을 변화시킨다. 또, 이 그룹이 DNA 염기에 결합하면 유리형의 ethidium bromide보다 형광이 증가된다. 파장 254 nm에서의 자외선은 DNA에 흡수되어 이 색소에 전달되고 파장이 302 nm와 366 nm에서는 색소 자체에 자외선이 흡수되어 590 nm의 주황색 형광 가시광선을 내게 된다. 이를 이용해서 DNA의 양과 존재유무를 알 수 있다. 이 때 DNA의 염기사이에 들어가서 올바른 반보존적 복제를 방해하여 변종 세포를 만들고 이 변종 세포가 암세포로 성장할 수도 있다.
2-3. 주변의 생물에서의 미생물의 분리 : 분리된 미생물의 관찰
* Gram staining
(1) 기본원리 : 박테리아의 세포벽을 구성하는 특정 구조(Peptidoglycan)와 화학 반응을 일으켜 염색반응이 일어난다.
(2) Gram (+) 세균 : 세포벽이 두꺼운 peptidoglycan layer와 풍부한 teicoic acid로 이루어져 있어서 탈색시 쉽게 탈색되지 않으므로 crystal violet이 계속 세균 내에 남아있어 보라색으로 염색된다.
(3) Gram (-) 세균 : peptodoglycan layer가 단일층으로 되어 있으며 세포벽이 지방성분이 풍부한 lipopolysaccharide로 이루어져 있어 탈색제에 의해 crystal violet이 쉽게 탈색되며 탈색 후 대조 염색액인 safranin O로 염색하면 붉은색을 나타낸다.

키워드

박테리아,   일반생물,   생명과학,   플라스미드,   효소