조단백 정량

목차

1. Abstract

2. Introduction

3. Materials & Method

4. Result & Discussion

5. Reference

본문내용

서 일어나는 색변화는 다음과 같다. 처음 용액의 색은 CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4 반응식에서 볼 수 있듯이 NaOH를 첨가하면서 Cu(OH)2이 생성되면서 푸른색을 나타낸다. 그리고 나서 Cu(OH)2이 다시 가열로 인해 분해되면서 Cu(OH)2 CuO + H2O 산화 제2구리(CuO)를 형성하면서 다갈색이 된다. 붕산이 들어있는 삼각플라스크는 붕산에 암모니아 NH3기체가 포집되면서 염기성을 띄게 되면서 옅은 초록색을 나타낸다. 그러므로 이 용액을 0.02N-HCl로 적정하면 염기성을 띄던 용액이 중화되면서 종결점에 다다르면 용액의 색이 변화하게 되는 것이다.
Homework
1. 단백질 정량법
단백질 농도를 정량하는 방법에는 UV법, Lowry법, BCA법, Bradford법, Biuret법 등이 있다. 각각의 감도, 간편함, 단백질의 종류에 의한 감도의 차이, 방해물질의 종류와 허용농도 및 반응액의 pH 등에 차이가 있으므로 대상에 따라 적당한 방법을 선택하여 사용한다.
자외선 흡수법은 단순히 단백질 용액의 흡광도를 분광 광도계로 측정하는 방법으로 단백질에는 주로 tyrosine 및 tryptophan의 측쇄로부터 유래된 280nm 부근의 흡수가 있으나 buffer에는 이 부분의 흡수를 가지는 것이 적기 때문에 이것을 측정한다. 측정법위는 0.1~1mg/ml 정도로서 간단하게 sample의 회수가 가능하지만 흡수는 tyrosine, tyrptophane의 비율과 입체구조에 의존하기 때문에 광학계수는 단백질에 따라 다르다. 따라서 흡광계수가 미리 알려져 있는 단백질의 농도를 결정할 경우, 먼저 chromatography를 행한 뒤, 어느 부근에 어느 정도의 단백질이 용출되는가를 대략적으로 조사할 경우에 적합하다. Column의 끝에 flow cell식의 흡광도계(UV모니터)를 붙이고 연속적으로 단백질의 용출 패턴을 monitor하는 것이 가능하다.
Lowry법은 단백질 정량에 있어서 Lowry법의 감도는 비교적 넓게 적용되기 때문에 오랫동안 광범위하게 이용되고 있다. 이 방법은 알칼리성에서 단백질의 peptide 결합과 구리가 반응하여 Cu+이온을 생성하는 Biuret 반응의 원리를 이용한 것이다. 발색의 정확한 기작은 밝혀지지 않았지만 Cu+ 이온은 방향족 아미노산의 산화를 유도하여 phospomolybdotungstate를 푸른색의 heteropolymolybdnum으로 환원시킨다. 이러한 반응 결과 강한 푸른색을 생성하며 그 강도는 tryptophan과 tyrosine양에 영향을 받는다. 이 방법은 단백질의 농도가 0.01~ 1.0mg/ml의 경우에 측정가능하다. 하지만 이 방법은 시료가 불안정하기 때문에 실험시 주의해야하는 점이 꽤 많은 편이다.
BCA(Bicinchoninc acid)법은 Lowry법을 계량한 것으로 Folin시약의 반응 대신 BCA가 구리이온과 복합체를 형성해 자색으로 발색되는 반응을 이용한 것이다. 반응은 두 단계로 일어난다.
protein + Cu2+ + OH- → Cu+
Cu+ + 2BCA → Cu+/BCA chromophore(562nm)
이 방법은 Lowry법과 비교해서 방해물질 특히 계면활성제의 영향을 받지 않고 생성물이 안정하다. 그러나 이 방법의 단점은 반응이 느리고 단백질이 변성된다는 것이다. 감도는0.5μg/ml정도이다.
Bradford법은 염색을 기초로 하는 분석법으로 comassie brilliant blue G-250이라고 하는 색소가 염기성과 방향족 아미노산 촉새와 결합하여 그 결과 흡수피크가 465nm에서 595nm로 이동하는 것을 이용한 방법이다. 산성조건에서 hydrophodic과 ionic interaction이 dye의 anonic형태를 안정화시킴으로써 가시적으로 색변화의 원인이 된다. 이 반응의 이점은 BCA법과 비교해 보다 간단하고 감도가 20~200μg/ml로 좋다. 그러나 단백질의 basic한 아미노산의 조성에 따라 염색되는 정도가 다르며 환원제와 EDTA의 영향은 거의 받지 않지만 계면활성제의 영향을 받기 쉽다. 또한 반응액이 산성이기 때문에 지질을 대량으로 함유하는 sample에서는 침전을 생성하는 경우가 있으며 단백질을 변성시킨다. 이 방법으로 단백질의 농도를 판단하기 위해서는 표준단백질의 검량선을 구하여 비교산출을 하도록 한다.
Biuret법은 두 개 이상의 펩티드 결합을 가지고 있는 단백질에 알칼리성 용액에서 묽은 황산구리로 처리했을 때 자주색을 띠는 물질을 생성한다. 색깔은 구리원자가 두 개의 펩티드 결합에서 오는 네 개의 -NH기 사이에 배위화합물을 형성함으로써 생기는 것으로 생각된다. 뷰렛실험은 단백질 백본의 펩티드 결합을 이용하는 방법이므로 모든 단백질에 대해서 재현성이 꽤 좋다. 그러나 감도가 1mg/ml정도이며 Pro은 복합체 형성에 참여할 수 없고 Cu2+ 가 Cu+로 환원하기 때문에 감도가 낮다.
2. 분해 촉진제 종류
① K2SO4, CuSO4
K2SO4 + H2SO4 → 2KHSO4
2KHSO4 → K2SO4 + H2O + SO3
: 황산의 끓는점을 높여주며, SO3를 생성하고, 탄소로부터 CO2가 되는 산화효과를 높여준다.
②CuSO4(황산구리), HgO(산화제2수은)
: 이를 소량 가하면 아미노산으로부터 암모니아를 생성하는 반응이 대단히 촉진된다.
③ CuSO4(황산구리)보다 HgO(산화제2수은)를 사용하면 분해 속도가 2～3배 빠르다.
3. 식품에서 조단백질 함량
식품
조단백질(%)
과실류
사과
0.3
토마토
1.3
수박
0.4
참외
0.9
곡류
현미
7.2
백미
6.5
밀
12.0
흰밥
2.7
감자 및 전분류
감자
2.4
고구마
1.1
육류
닭고기
20.7
돼지고기
17.8
쇠고기
18.6
채소류
배추
1.3
시금치
2.6
호박
2.0
가지
1.2
REFERENCE
1. 신효선, 식품분석, 신광출판사, 1983, p81~87, p293
2. 윤석권, 식품화학, 수학사, 2008, p194, p215
3. 박기채, 분석화학, 탐구당, 1998, p651-654
4. 해양수산연구정보원
5. 네이버 블로그
6. 구글

키워드

존단백,   분해촉진제,   켈달법