세포배양실험

소개글

세포배양실험에 대한 보고서 자료입니다.

본문내용

2번정도 washing한다.
trypsin-EDTA solution을 적당량 첨가하여 2-3분정도 incubation한다.
바닥으로부터 cell이 떨어지기 시작하면 serum-added medium을 첨가하여 trypsin-EDTA를 inhition시킨다.
tube에 위의 cell suspension을 옮긴 후 1900rpm에서 2분간 원심분리한다.
cell pellet만 남기고 위의 상층액은 모두 suction 한다.
cell stock solution을 적당량 첨가하여 suspension한다.
동결바이알에 1ml정도 각각 분주한 후 빨리 냉동실로 옮긴다.
cell은 냉동실에서 1-2시간정도 동결시키고, 70도 deep freezer에서 하루 둔 다음날 질소탱크로 옮겨 보관한다.
② Suspension cell의 경우 - THP-1 cell, U937 cell ect.
cell suspendion을 옮긴 후 1900rpm에서 2분간 centrifuge한다.
상층액을 suction한 다음 10%DMS인 FBS를 첨가한 후 동결 바이알에 1ml씩 옮긴다.
스티로폼에 바이알을 넣고 deep freezer에서 하루 정도 둔다.
질소탱크로 옮겨 보관한다.
* 동결시키는 cell의 density는 106cells/ml보다 높아야 한다.
6. 동결세포의 해동
해동 과정에서도 동결과정에서와 마찬가지의 기계적, 화학적, 물리적 영향을 받게 되는데 두 과정의 차이점은 처음 시작하는 세포의 상태에 있다. 동결과정의 경우 충분히 수화된 세포가 주변환경과 평형을 이룬 상태에서 자작하지만 해동 과정의 경우 동결건조상태이거나 세포내 얼음 결정이 존재하는 상태에서 자작하게 된다. 만약 해동과정이 천천히 이루어진다면 세포외액 으로부터 세포내로 수분이 유입되면서 세포내의 얼음 재결정화(recrystalization)현상이 발생하게 된다. 즉 해동 시 전체 얼음의 양은 감소하지만 재결정화 현상이 발생하며 이것은 세포에 치명적인 손상을 입히게 된다. 따라서 해동과정을 최대한 신속히 진행하여야 해동 후 세포 생존율이 증가할 수 있다. 일반적으로 액체질소 용기에서 동결바이알을 37℃ 수조로 옮겨 1분 내에 해동시킨다(1200℃/min).
해동속도는 액체질소에서 37℃ 수조로 동결바이알을 옮기는 방법으로 최대한 신속히 진행하여야(1200℃/min) 최대의 세포생존율을 얻을 수 있다.
①동결세포의 해동(Thawing) Method
앰플을 드라이아이스 용기에서 꺼낸후 37-40℃의 water bath에 넣는다.
40-60초 동안 신속하게 녹인다.
얼음이 녹자마자 수조에서 앰플을 꺼낸 후 상온의 70%알콜로 소독한다. 이 순간부터 무균작업대에서 작업을 실시한다.
앰플뚜껑을 연다.
DMSO(dimethylsulfoxide)를 제거하기 위하여 15ml 튜브에 키우고자하는 배양액(10% FBS가 첨가된 RPMI1640 혹은 DMEM)을 10ml 정도 넣은 다음 앰플속의 세포부유액(1-1.5ml)을 옮긴다.
1,900 rpm에서 2분간 원심분리한다.
상층액을 제거한 후, 약 5ml의 배지에 cell pellet을 부유시킨다.
배양용 플라스크(T25cm2)에 세포부유액(cell suspension)을 옮긴다.
플라스크에 세포이름과 배양날짜 배지 등을 기입한다.
5%의 CO2, 37℃의 배양기에서 배양한다.
배지는 세포가 자라는 양상을 관찰하면서 교체한다. 즉, 바닥면적의 약 80%이상을 세포들이 차지하며 배지의 색깔이 변하면 배지의 약 80%정도를 교체해 준다. 12. 세포가 충분히 자랐을 경우, 필요에 따라 T75cm2플라스크에 옮긴다.

키워드

세포,   cell culture,   세포배양,   계대배양,   세포동결