plasid mini prep

목차

1. Plasmid Mini prep & PCR & Agarose Gel Electrophoresis
3.21.~28.

2. Enzyme digestion & Gel extraction
4.4.

3. Ligation & Transformation
4.18.

4. Agarose gel electrophoresis & Confirm the plasmid DNA
4.25.

본문내용

lumn
Bead
장점
* 비교적 깨끗한 DNA를 추출할 수 있다.* 과정이 간편하다.
* DNA elution buffer volume에 크게 제한됨이 없어 추출한 DNA 농도(ng/㎕)는 어느 정도 조정 가능하다.* 자른 gel의 크기에 대해서 부담이 적다.
단점
* 정해진 elution buffer volume(최소 30㎕)으로 인하여 추출한 DNA농도(ng/㎕)가 적어질 수 있다.* 자른 gel의 크기에 제한성이 있다.* 가격이 다소 비싼 편이다.
* 부주위로 순수한 DNA를 얻지 못하거나 추출 효율이 다소 떨어지는 경우도 있다.* 과정이 column에 비해서 많은 편이다.
※ PCR product purification
03. Ligation of termini created by restriction enzymes
이제 양끝에 제한효소부위를 가지는 insert DNA 와 동일한 제한효소 부위를 가지는 vector가 준비 되었습니다. 그러면 서로 이어 붙여야겠죠.
여기서 이용이 되는 효소가 바로 DNA ligase인데 대표적으로 T4 DNA ligase와 E.coli DNA ligase가 존재합니다.
이제 두 효소들에 대한 기본 원리 및 종류 그리고 이용성에 대해서 간단히 살펴보도록 하겠습니다.
1) DNA ligase의 기본 원리
: nick이 생긴 DNA 또는 linear form인 두 종류의 DNA를 5’-phosphodiester bond를 이루도록 하여 서로 연결시키는 반응입니다. 두 효소는 주로 DNA 염기서열 repair mechanism에서 사용되며 DNA복제 시 okazaki fragment를 서로 이어주는데 역할을 하는데, 유전공학에서는 이러한 원리를 이용하여 blunt-end, cohesive end DNA 등을 연결시키는데 DNA ligase를 사용하고 있습니다.
2) DNA ligase mechanism
DNA ligase는 아래 3가지 반응단계를 볼 수 있습니다.
① 효소 내에 lysine 잔기(-NH)에 ATP가 결합함에 따라 AMP가 효소에 공유결합 형성
② Nicked DNA가닥의 5’phosphate에 AMP nucleotide가 전달.
③ Nicked DNA의 3’OH 와 phosphate골격이 sealing된다. 이로 인해 AMP-DNA결합이 공격을 받게 되고 결국 AMP가 떨어져 나가게 된다.
1) Transformation이란?
: 형질전환(transformation)이란 외부 DNA를 숙주 세포 내에 넣어주어 세포가 원래의 성질과는 다른 새로운 유전형질을 추가로 얻게 되는 것을 말합니다.
2) Transformation의 개요
: E. coil의 형질전환은 초기에는 발견이 되지 않았으나 bacteria를 차가운 CaCl2로 처리한 다음 잠시 열처리를 하면 bacteriophage λ가 세포 내로 들어가 phage를 형성한다는 사실에 의해 처음 관찰되었습니다.
3) Competent cell이란?
: Competent cell이란 정상적인 bacteria에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell을 의미합니다. ligation을 마친 DNA나, circular 형태의 Plasmid를 증폭하기 위해서, 혹은 cloning을 끝내고 완성된 vector가 있는데 그것을 expression하기 위해서 E.coli에 transformation을 해야 합니다. 이때 사용하는 E.coli host cell을 competent cell이라고 부릅니다.
① competent cell기본 제조 원리를 살펴보면,
E. coli cell이 DNA를 흡수 할 수 있는 상태가 되어야 할 것 입니다.
이것이 가능하기 위해서는 DNA가 세포막 주위에 존재해야 하는데 DNA는 phosphate에 의해 (-)charge를 띠며 세포막 또한 diacrylglycerol이 (-)charge를 띠기 때문에 서로 척력이 발생합니다. 따라서 이를 중화시키기 위해 divalent cation(Ca2+, Rb2+) 등을 사용합니다. 세포막 고유 charge가 변하게 됨에 따라 막 구조의 불안정이 야기되어 흐물흐물한 상황이 됩니다.
Competent cell 제조 시 항상 낮은 온도(약4℃)에서 수행해야 한다는 것을 명심하세요.
저온유지는 세포막을 응고시켜 charge의 분포를 안정화시키며 cation에 의하여 효과적인 charge shield 형성에 도움을 주게 됩니다.
② competent cell에 의한 유전자 삽입 과정 원리를 살펴보면,
유전자를 얼음에 저장되어 있는 competent cell에 주입하게 되면 divalent cation에 의해 세포막주위에 (-) charge를 가지는 유전자가 붙게 됩니다. 이때 42℃ 온도에서 순간적으로 (30sec~1min30sec) heat shock을 주게 되면 E. coli membrane 내외의 thermal imbalance가 생겨 DNA가 세포 안으로 빨려 들어가게 됩니다. 외에 electroporation에 의한 transformation으로 electric charge를 E. coli cell에 순간적으로 가하여 이때 생긴 pore를 통해 DNA를 세포 안으로 넣는 방법이 있습니다.
③ competent cell에 의한 유전자 삽입 과정 모식도
X-gal은 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside의 약자입니다. 일단 X-gal을 설명하기 위해선 먼저 Lac operon이라는 것을 알아야 합니다. 이는 박테리아에서 시행되는 유전자 발현 조절 기구입니다. Lac operon은 lactose를 glucose와 galactose로 분해하는데 쓰이는 operon입니다.
-실험 순서-
Plasmid Mini prep & PCR & Agarose Gel Electrophoresis
3.21.~28.
Enzyme digestion & Gel extraction
4.4.
Ligation & Transformation
4.18.
Agarose gel electrophoresis & Confirm the plasmid DNA
4.25.

키워드

PCR,   mini prep,   ligation,   transformation,   전기영동,   digestion,   agarose