플라스미드 dna 시험법

소개글

플라스미드 dna 시험법에 대한 보고서 자료입니다.

목차

● 실험방법
1. Microfuge tube에 E.coli culture를 1.5mL(tube가 넘치지 않을 만큼)채운다. 그 후, maximum speed로 centrifuge를 30초가량 시행한다. 우리 조의 경우 15000rpm의 속도로 centrifuge를 시행하였다. 이때 Temperature는 room Temperature도 무관하다.
2. centrifuge한 microfuge의 medium(상층액) 부분을 aspiration하여 제거 한다. 잔여 medium은 20㎕의 pipet을 이용하여 최대한 제거하려고 하였고, medium을 따뤄낼때 pellet이 풀어지지 않게 하기 위해 pellet이 위쪽으로 향하도록 따뤄내었다.
3. tube에 sol.I을 100㎕넣어서 vortex를 이용하여 sol.I이 cell을 잘 mix 될 수 있도록 한다.

본문내용

NA를 전기영동하고 agarose gel에서 분리하여 준비하였다.
실험방법
1.agarose gel powder 0.25g과 TAE buffer에 넣어 1% agarose gel을 만드는데 Microwave를 이용하면 더 손쉽게 할 수 있다. (2~3분씩 여러 번 나누어서 용해정도를 보면서 Microwave한다.) gel tray와 gel stand를 활용하여 30분 정도 굳혀주면 agarose gel이 완성된다.
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2.marker는 3㎕로 DNA는 4㎕로 gel wall에 inject하여 전기영동 한다.
*무분별한 loading buffer의 사용을 줄이기 위해 이번 실험에서는 microfuge tube에서 mixing을 하는 대신 parafilm을 이용하기로 하였다. 위 그림과 같이 parafilm 위에 loading buffer 1㎕를 전기영동을 하게 될 vector DNA의 수만큼 나누어서 drop하여 sample 4㎕와 mixing 하였다.
3. 100V에서 전기영동을 대략 10~20분가량 하게 되면 gel상에 band가 DNA의 크기나 무게에 따라 밴드로 분류가 되는데 이것은 EtBr (Ethidium Bromide)에 일정 시간 담궈 염색을 한 후에 UV(Ultra Violet)를 비추게 되면 육안으로 확인이 가능하게 된다. 이때 EtBr의 경우 발암 물질이므로 특히 실험 중 취급에 주의하여야한다.
실험결과
위 실험 방법에 따라 plasmid DNA를 전기영동하고, UV를 비춰 찍은 사진이다. 중간에 선명하게 하나의 band로 나타난 것은 대조군으로 쓰기위한 standard marker이고, 주변의 분명치 않은 부분은 보는 바와 같이 어떠한 이유에서인지는 모르겠지만 전기영동이 전혀 이루어 지지 않았다.
고찰
: 실험 결과에서처럼 제대로 된 Vector DNA를 얻어내지 못하였다. 우리는 과연 여기서 무엇을 잘못하였기에 이러한 결과가 나왔는지 의문을 안 가질 수 없다. 조교님의 말씀을 미뤄보건 데 아무래도 agarose gel을 굳힐 때에 문제가 있었던 것으로 고려된다. gel이 약20~30분가량 굳혔으나 굳어진 상태가 덜 굳어진 상태이다 보니 전기영동을 하여도 위의 실험 결과와 같이 나왔을 것으로 미뤄 짐작해본다.
Insert DNA제조
DNA 3㎕
10×buffer 1㎕
PstI 0.3㎕
dH2O 5.7㎕
Total10㎕
※5시간 동안 반응 후 냉장고 보관

키워드

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