PCR&transformation

소개글

PCR&transformation에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1.PCR
-PCR에 쓰인 재료의 역할
-PCR과정
-PCR시 고려사항

2.전기영동
-전기영동 과정

3.Ligation
-Ligation 과정

4.Transformation

5.Plasmid seperation

6.Enzyme cutting

7.최종결과

본문내용

sh solution A)로 씻어낸다. Buffer AW에는 70~80%의 에탄올이 들어있어 빨리 돌려서는 안 되며, 씻어낸 이후 SV collection Tube와 column을 분리하여 밑에 빠져나온 이물질은 버리고 column에 다시 넣고 Buffer PW(column wash solution P)를 다시 처리한다. 이 용액은 AW와는 에탄올 비율이 다르므로 조금 더 정밀하게 DNA를 정제할 수 있다. washing을 두 번하는 이유는 하면 할수록 DNA의 순도가 높아지기 때문이다.
Wash Buffer를 제거하기 위해 1분 동안 원심분리를 하고 1.5mL tube로 옮겨 담는다. 그 후 3차 증류수를 넣는다. 이 때 주의할 점은 표면장력 때문에 바깥쪽에 떨어뜨리는 것보다는 column의 가운데로 떨어뜨리는 것이 DNA수득률을 높일 수 있다. 그리고 1분간 기다려야 하는데, 증류수와 DNA가 손잡는 시간이 필요하기 때문이다. DNA는 column보다 3차 증류수와 친화력이 크다. 마지막으로 1분간 다시 원심분리를 한다.
6.Enzyme cutting
plasmid DNA, EcoRI, EcoRI buffer, 3차 증류수로 반응 혼합물을 만든다. T-vector를 이용한 경우 DNA insert는 EcoRV 효소위치에 삽입된다. 삽입된 부위의 가장자리를 EcoRV효소로 처리하면 존재여부를 확인할 수 있다. 이 과정을 거친 후, 37℃에서 30분간 인큐베이터에 보관한다. 마지막으로, 100V 전압을 가하여 25분간 전기영동을 한다. 이 때 쓰인 marker는 1kbp DNA ladder이며, 벡터 사이즈가 크기 때문에 이것을 쓴다.
7.최종결과
전기영동 결과에서 각 콜로니별로 플라스미드 DNA와 PCR산물의 위치가 나타났다. 왼쪽의 WI(white colony1)에 희미하게 나타난 밴드가 있는데 이것은 우리가 원하는 PCR산물의 결과이다. 정확히 말하면, 461bp이다. 희미하게 나온 이유는 화이트콜로니 내에서 원하는 유전자가 삽입된 플라스미드가 매우 드물었기 때문이라고 추측한다. W2(white colony2)는 다른 유전자가 삽입된 플라스미드에서 나온 결과로 아주 희미하게 나타난다. 사진을 아주 크게 확대해야만 겨우 보일정도로 희미하게 나왔다. 왼쪽의 밴드와 다른 위치에 있는 것으로 보아 확실히 다른 종류의 DNA임을 알 수 있다. 마지막의 b(blue colony)는 라이게이션 되지 않았으나 트랜스포메이션 된 플라스미드에서 나온 결과로, 외부 유전자 자체가 삽입되지 않았기 때문에, 원래는 어떤 밴드도 나오지 않아야 한다.
하지만 최종 전기영동 결과에서 맨 끝줄에 플라스미드 DNA가 아닌 띠가 발견되었다. 분자량이 높은 띠가 발견되었는데 이는 엔자임 컷팅이나 플라스미드 세퍼레이션을 할 때 손에서 섞여 들어갔을지도 모른다. 그러나 실험과정을 관찰하거나 실행하였을 때는 그다지 실수점을 발견하지 못했기 때문에, 외부 DNA가 아닐 가능성도 있다. 외부 DNA가 아닐 경우 세포 내의 고유 DNA일 가능성도 배제할 수 없다.

키워드

PCR,   transformation,   유전자