[미생물학실험] 미생물 생균수 측정

목차

◉실험 제목 : < 미생물 수 측정 >
◉실험 목적
◉실험 원리
　◎ 표면 평판법(Surface plating)
◉시약 및 기구
◉실험 방법
◉고찰
◉토의
< 미생물 수의 측정 >
※ 균수의 측정
　1) 현미경 직접계수법(direct microscopic count)
　2) 흡광도 측정
　3) 균체량 측정
　4) 평판계수법
　5) most probable number procedure(MPN 법)

※ 참고문헌

본문내용

광계(Photocolorimetry)에서의 빛의 경로를 표시한 것이다. 전구에서 나온 백색광은 회절격자(Diffraction grating)에 의해서 일정한 파장 순서의 스펙트럼으로 배열되므로 파장조절장치를 이용하여 우리가 원하는 단일파장의 빛을 시료에 투사할 수가 있게 된다. 시료를 투과한 빛은 광전판(Phototube)을 거쳐서 검류계(Galvanometer)에 백분율로 표시할 수 있게 된다. 이때 투과된 빛의 양은 시료 속의 균체 수에 반비례한다. 따라서 여러 가지 비율로 희석된 배양액의 흡광도(Optical Density, O.D)를 잰 다음 각 흡광도에서의 정확한 세포수를 알아내어 이들의 상관관계를 구해 놓으면 흡광도 측정만으로도 미지의 균체 수를 알아낼 수 있을 것이다.
3) 균체량 측정
균체량을 무게나 부피로부터 직접 측정하는 방법으로서 배지성분의 혼입이나 고형 배지에 포함되어 있는 수분의 양에 따라 결과가 달라질 수 있으며, 소량의 균체의 경우 정확도가 떨어지고 균체가 대량일 경우에는 비교적 정확한 결과를 얻을 수 있다.
고형배지상의 균체량의 측정은 습윤균체량 측정법을 이용하며, 액체배양의 경우는 균체용량 측정법을 이용하는 것이 오차를 줄일 수 있다. 그러나 이들은 모두 수분에 의한 오차가 나타날 수 있으므로 수분에 의한 오차를 최소화하는 방법으로 건조균체량 측정법이 있다.
4) 평판계수법
① 주입 평판법(pour plating)
적절히 희석된 시료나 세균 배양액을 접종한 페트리 접시에 45～50℃로 식힌 액체배지를 주입하여 골고루 분산시켜 배양하면 단일 콜로니를 형성시킬 수 있다. 절대 혐기성균에 유리하다.
② 표면 평판법(Surface plating)
여러 종의 미생물이 혼합되어 있는 시료나 배양액에서 도말 평판법과 주입 평판법을 통해 분리된 단일 콜로니는 몇 번의 계대배양을 통해 순수한 단일 콜로니(Single Colony)로 분리될 수 있다. Surface plate는 순수 분리에 사용되는 쉽고 간단한 방법이다. 이 방법의 기본 원리는 한천 평판배지에 소량의 시료를 넓게 펴서 세균의 밀도를 낮춰(희석, Dilution) 단일 콜로니를 얻는 것이다.
⇒ 주입 평판법(pour plating)과 Surface plating를 평판계수법이라 한다. 표면평판법은 뜨거운 한천배지에 의해 손상 받을 수 있는 열 감수성 미생물의 측정에 적합하며, 절대호기성균( obligate aerobes)은 한천배지 표면에서 빨리 자라서 큰 집락을 생성한다. 이 방법에서 중요한 것은 시료를 적절히 희석하여 형성되는 집락수가 적당해야 한다는 점이다. 실제로 통계적으로 가장 유효한 집락의 수는 평판당 25～250개 사이이다.
생균수 측정으로 얻어지는 집락의 수는 접종량(inoculum size)뿐만 아니라, 사용되는 배지의 적합성과 배양조건 등이 영향을 미친다. 또한 2개 이상의 균이 뭉쳐서 하나의 집락을 형성한다면 실제 균수보다 적게 측정된다. 이러한 이유로 생균수의 측정은 생균수(viable cell count)라기보다는 집락형성 단위(colony-forming unit, cfu/㎖ 혹은 cfu/g)로서 표현된다.
이 방법은 여러 가지 어려운 점도 있지만, 생균수의 측정방법으로 가장 좋은 방법이며 폭넓게 사용되고 있다. 이 방법은 균수가 적은 시료에서도 측정이 가능하여 원료나 제품의 미생물학적 오염을 감지할 수 있다. 더욱이 혼합 균주배양액 또는 오염된 시료로부터 특정한 균의 수를 선별배지(selective media)를 사용하여 측정할 수도 있다.
5) most probable number procedure(MPN 법)
3개의 연속된 희석배수에서 균이 존재하는 시험관의 수를 읽어 MPN표를 이용하여 MPN값을 알아낸다. 이렇게 구한 MPN값에 희석배수를 곱하여서 균수(MPN/g)를 측정할 수 있다. 이 방법은 정확도가 낮다는 단점이 있으나 평판계수법보다 비교적 간단하다. 시료 중 미생물의 농도가 낮을 경우에 특히 적합하여 수중의 대장균 수를 측정하는데 사용된다. 균수를 표시할 때는 소수점 1자리로 표시한다.
※마이크로피펫(micropipette)은 외과의사가 메스를 쓰는 것과 같이 분자생물학을 실험하는 사람들의 주된 도구이다. 마이크로파이펫을 얼마나 능숙하게 쓰느냐에 따라서 실험의 결과가 크게 달라진다. 마이크로파이펫은 용량에 따라서 여러 가지가 있지만, 주로 네 가지 종류를 사용한다. 용량의 단위는 microliter이다.
이 용량은 마이크로파이펫 손잡이에 붙어있는 라벨로 알 수 있다. 아래 그림의 왼쪽으로부터 1000 microliter (이것만 파란색이고 나머지는 노랑색), 200 microliter, 100 microliter, 20 microliter 짜리이다.
파이펫 옆을 보면 숫자눈금이 있는데 붉은색 글씨가 소수점 아래 또는 1000 단위(microliter) 를 나타낸다. 따라서 왼쪽으로부터 가리키는 숫자는 각각 1000 microliter(즉, 1 ml 입니다) , 200 microliter, 100 microliter, 20.0 microliter 가 된다. 이렇게 한 번에 파이펫으로 취하는 용량은 파이펫 머리부분의 돌리는 손잡이로 조절한다. 실험할 때는 사용하는 용량과 비슷한 범위의 마이크로파이펫을 써야한다.
마이크로파이펫은 disposable tip을 사용한다. 파이펫의 용량 라벨의 색과 같은 tip을 쓰면 된다. 1000 microliter 짜리 피펫만 blue tip을 쓰고 나머지는 yellow tip을 사용한다. 여기에는 나와있지 않은데, 10 microliter 짜리 초소형 white tip도 있다.
마이크로파이펫은 다음과 같이 사용한다.
※ 참고문헌
1. 환경 미생물학, 김종오 외, 형설출판사, 1998, 539～547page
2. 최신 식품 미생물학, 유태종 외, 문운당, 2000, 105～107page
3. http://cpi.yonsei.ac.kr/text242.fb.htm
4. Roger Y. stainer, 최신미생물학. 1993년. 아카데미서적
5. Ronald M. atlas, 미생물생태학. 1991년. 우성서적

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