Ex2_DEAE sepharose anion exchange chromatography

소개글

Ex2_DEAE sepharose anion exchange chromatography에 대한 보고서 자료입니다.

본문내용

10배인 5ml의 양으로 wash를 해주어야 하는데, 한번에 5ml를 쓰는 것이 아니라 1ml씩 총 5번을 wash해준다. wash를 해줄 때에는 bead와 buffer가 다 뒤집힐 정도로 수직으로 강하게 분사한다. 강하게 분사하면 tip에 용액이 묻을 수가 있으므로 파이펫을 위로 올리면서 loading을 한다. 또한 완전히 wash액이 내려가기 전에 또 buffer를 loading을 해줘야 한다. bead가 마르면 안되기 때문이다. bead가 평탄하지 않으면 P.M이 bead를 골고루 통과하지 못하기 때문에 마지막 wash인 다섯 번째에서는 노란 고무패킹으로 밑을 막고 bead packing(평탄화 작용)을 해준다. Protein mixture를 loading 할 때는 bead가 흐트러지지 않도록 조심스럽게 돌려가면서 골고루 분사한다. Protein mixture는 eution bead의 2배인 1ml를 loading 해준다. protein mixture를 loading한 후에 bead wash 3번을 추가로 해줘야 하는데 그 이유는 charge와 관계없이 resin에 껴있는 protein들을 제거해 주기 위함이다. 6번 과정을 거치면 (+)charge를 띈 protein들은 모두 용출되고, 중성이거나 (-)를 띈 입자들이 bead와 결합을 하고 있을 것이다. Counter ion을 넣어주어 결합을 끊기 위해 농도가 다른 NaCl solution을 50mM→100mM→150mM→200mM순으로 두 번 에 나누어 넣어준다. 농도를 달리 하는 것은 결합세기에 차이를 두는 것이고, 두 번에 나누어 넣어주는 것은 속도요인을 고려한 것이다. 저농도에서 고농도로 fraction을 시키면 bead와 친화력이 작은 단백질에서부터 큰 단백질 순서로 뽑아낼 수 있다. 용출되어 모아진 것들은 protein을 함유하고 있기 때문에 변성을 막기 위해 Ice box에 넣어 보관해야 한다. 우리가 AP가 없는 Flow through를 따로 모아주는 이유는 Flow through가 SDS-PAGE에서 대조군으로 작용하기 때문이다. P.M는 있고 F.T에는 없는 것을 AP로 추정할 수 있다. 대게 정제된 양의 35%정도를 AP라고 추정한다. 1M~2M의 고농도인 NaCl로 wash를 하고 20% 에탄올에 저온(4·C)상태로 보관하면 재활용 할 수 있다.
Reference
단백질 실험 핸드북/역자 강호일/월드사이언스/32-33page

키워드

DEAE-sepharose,   이온교환 크로마토그래피,   ion-exchange chromatography,   column chromatography,   이온교환 크로마토그래피