유전자 재조합 단백질의 정제 (Affinity chromatography, Ion chromatography, gel chromatography 설명 & Protease inhibitor의 종류와 사용방법 & 단백질분리정제에 이용되는 fusion tag의 종류와 특성)

소개글

유전자 재조합 단백질의 정제 (Affinity chromatography, Ion chromatography, gel chromatography 설명 & Protease inhibitor의 종류와 사용방법 & 단백질분리정제에 이용되는 fusion tag의 종류와 특성)에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 9R-1. Affinity chromatography, Ion chromatography, gel chromatography를 각각 설명하라.

2. 9R-2. Protease inhibitor의 종류와 사용방법을 설명하라.

3. 9R-3. 단백질분리정제에 이용되는 fusion tag의 종류와 특성을 설명하라.

본문내용

로테인 A, 프로테인 G, 글루타티온-S-전이효소(GST), His6 등이 있다.
■사용법
: 이들 융합단백질은 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 분리할 수 있다. 목적 단백질의 N-말단에 GST를 결합시킨 경우 GST의 기질인 글루타치온 고정 매개체로 채워진 column에 통과시키면 효소-기질 반응에 의해 GST 융합단백질만이 column에 남아 간편하게 다른 세포 내 단백질들로부터 분리할 수 있다. His tag의 경우 Ni2+ 이온이 있는 컬럼을 이용하여 흡착시켜 분리할 수 있다. 꼬리표는 적절한 처리를 통해 목적 단백질의 말단 부위로부터 떼어낼 수 있다.
■장점
: 특정 펩티드 또는 다른 단백질과 결합하여 목적단백질을 발현시키면 목적 단백질의 원래의 용해도 보다 더 높은 용해도의 단백질을 얻을 수 있다. 그리고 숙주 세포 내의 단백질 분해효소로 인해 목적 단백질이 분해되는 것을 방지하여 발현 도중 안정성을 높여 발현 수율을 높일 수도 있다.
※참고)
■ His-tag 재조합 단백질분리정제
: His Tag를 붙인 재조합 단백질(目的蛋白)을 in vivo 또는 in vitro로 합성해, 동시에 생성하는 많은 협잡단백으로부터 목적 단백을 분리 정제 한다. His Tag란 유전자 재조합 기술을 이용해 목적 단백의 말단에 히스티딘이라고 하는 아미노산을 6개 부가한 것으로써, 니켈, 킬레이트 수지를 이용해 히스티딘을 흡착하여 목적 단백만을 포집 하기 위해서 붙인 Tag이다. His-tag은 여러종류의 숙주세포에서 쉽게 발현시킬 수 있고, 짧은 배열의 염기를 붙이는 것만으로도 발현시킬 수 있기 때문에 사용하기 쉽다.
유전자 재조합으로 단백질의 말단에 6개의 히스티딘(Tag)을 부가한 단백질을 만들면, Ni킬레이트 수지에 의해 히스티딘의 부분을 흡착할 수 있으므로 다른 협잡단백으로부터 목적 단백만을 정제 할 수 있다.(위 그림 참조)
His-tag 재조합 단백질은 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 쉽게 분리할 수 있다. His-tag을 발현시킨 재조합 단백질이 포함되어 있는 단백질 시료를 Ni2+가 결합되어 있는 gel을 채운 컬럼에 통과시킨 다음 세척 완충액을 컬럼으로 흘려준다. 그러면 his-tag 재조합 단백질만이 Ni2+에 부착되고 나머지 단백질을 그대로 column을 빠져나온다. Ni2+에 부착된 his-tag 재조합 단백질은 고농도의 histidine이나 이미다졸을 흘려주면 gel로부터 분리 된다. His-tag 단백질이 Ni-gel에 부착되어 있는 정도를 모르는 경우가 많기 때문에 his-tag 단백질을 모으기 위해 흘려주는 이미다졸 용액은 일반적으로 50, 100, 200 mM 등으로 농도를 변화시키면서 목표 단백질의 분리조건을 최적화한다.
■GST fusion protein
glutathione-S-transferase의 약자로 목적으로하는 기질과 강하게 결합하는 성질때문에 발현시킬 단백질의 정제용으로 보통 fusion 시켜 이용한다.

키워드

Affinity Chromatogra,   Ion chromatography,   gel chromatography,   Protease inhibitor의,   fusion tag의 종류와 특성,   유전자 재조합