[생화학 실험보고서] Protein over expression in E. coli and purification by affinity chromatography

본문내용

ein을 제거하기 위한 washing buffer에 target protein이 딸려 내려온 것은 20 mM imidazole concentration이 우리가 넣은 6X-His tagged protein을 washing하는데 약간 높은 농도임을 알 수 있다(선행실험과 비교하였을 때 resuspension이 잘 이루어지지 않아 affinity chromatography를 실시한 총 양이 더 적다.).
3) Elution 1~4를 비교하였을 때, 1번과 4번에 비해 2번과 3번에서의 target protein의 양(or yield)이 더 많다. 이는 elution을 처음 시작할 때와 마지막으로 양이 얼마 남지 않았을 때보다 elution 중간과정에서 수득되는 target protein의 양이 더 많은 것으로 해석 가능하고, 실험에 전체적인 오류가 없는 것으로 생각할 수 있다.
4) Purification은 거의 변화가 없으면서 yield를 많이 감소시키는 step은 처음 centrifugation과 Flow-through step이다(이는 Supernatant의 purification, yield와 PPT의 yield, Flow-through의 yeild를 확인하여 얻어낼 수 있는 결과이다. PPT, F/T, washing의 purification은 상대적으로 덜 유익한 정보를 갖는다고 할 수 있다.). PPT와 F/T에서 Yield가 높은 것은 각각 resuspension이 제대로 이루어지지 않은 cell에 포함된 target protein과 F/T에서 bead에 affinity binding하지 못하고 떨어져 나간 target protein 때문이다. 하지만 두 가지 step 모두 꼭 필요한 step이므로 resuspension, resin equilibrium을 보다 신경써 수행하여야 할 것이다.
5) 실험에 사용된 모든 buffer에는 NaPi(pH 7.4, Na2HPO4, NaH2PO4), 300 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, DTT를 포함하고 있다. 이들은 각각 pH를 일정한 값으로 유지(protein의 pI 값), protein의 charge 보완, disulfide bond를 제거하여 protein의 native form 유지라는 목적으로 이용되었다.
6) 우리는 10 ml의 E. coli를 배양하여 총 940 ㎍의 target protein을 수득하였다. 만약 10 mg 의 target protein을 얻고 싶다면
10 ml : x ml = 940 ㎍ : 10000 ㎍, ∴ x = 106.38 ml
따라서 106.38 ml의 E. coli를 배양해야 10 mg양의 target protein을 얻어낼 수 있다.
7. 참고문헌
1) 생화학실험(2) 실험교본, 교육과학기술부의생명특성화사업단.
2) Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer. 2007, Biochemistry, sixth ed.
3) http://en.wikipedia.org/wiki/

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