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affinity를 낮추어 결합을
끊어준다. 이 과정이 실질적으로 fibronectin을 분리해내는 과정이다.
여섯 번째, 8M의 Urea와 e.q buffer를 column에 넣어 resin에 결합한 모든 protein을 끊어 제거한 후, column을 washing한다.
전반적인 실험이 빠르게 진행되어 미리
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로테인 A, 프로테인 G, 글루타티온-S-전이효소(GST), His6 등이 있다.
■사용법
: 이들 융합단백질은 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 분리할 수 있다. 목적 단백질의 N-말단에 GST를 결합시킨 경우 GST의 기질인 글루타치온 고정
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affinity binding하지 못하고 떨어져 나간 target protein 때문이다. 하지만 두 가지 step 모두 꼭 필요한 step이므로 resuspension, resin equilibrium을 보다 신경써 수행하여야 할 것이다.
5) 실험에 사용된 모든 buffer에는 NaPi(pH 7.4, Na2HPO4, NaH2PO4), 300 mM NaCl, 5 mM β-
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Affinity chromatography packing
3.3 Sample 준비
3.4 Sample loading
3.5 Resin washing
3.6 Sampling
4. Dialysis
4.1 Buffer 만들기
4.2 1,2 차 Dialysis
5. Bradford
5.1 Bradford
5.2 UV spectrophotometry
6. SDS PAGE
6.1 PAGE gel 조성 및 준
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원하는 밴드 외에 나타난 다른 단백질의 밴드를 없애기 위해 바꿔줘야 할 condition은 무엇일까?
Q2) Affinity chromatography 중에서
Ni-NTA vs. GST(glutathione S-transferase) →elution 원리의 차이
Q3) SDS-PAGE에서 APS, TEMED, sampling buffer조성
5.Reference
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