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Bradford
6. SDS PAGE
Ⅱ 실 험
1. Cell culture
1.1 LB 배지 만들기
1.2 1,2차 Seeding
2. Harvest
2.1 Harvest
2.2 Cell lysis
3. Protein purification
3.1 Buffer 만들기
3.2 Affinity chromatography packing
3.3 Sample 준비
3.4 Sample
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affinity를 낮추어 결합을
끊어준다. 이 과정이 실질적으로 fibronectin을 분리해내는 과정이다.
여섯 번째, 8M의 Urea와 e.q buffer를 column에 넣어 resin에 결합한 모든 protein을 끊어 제거한 후, column을 washing한다.
전반적인 실험이 빠르게 진행되어 미리
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로테인 A, 프로테인 G, 글루타티온-S-전이효소(GST), His6 등이 있다.
■사용법
: 이들 융합단백질은 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 분리할 수 있다. 목적 단백질의 N-말단에 GST를 결합시킨 경우 GST의 기질인 글루타치온 고정
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원하는 밴드 외에 나타난 다른 단백질의 밴드를 없애기 위해 바꿔줘야 할 condition은 무엇일까?
Q2) Affinity chromatography 중에서
Ni-NTA vs. GST(glutathione S-transferase) →elution 원리의 차이
Q3) SDS-PAGE에서 APS, TEMED, sampling buffer조성
5.Reference
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affinity binding하지 못하고 떨어져 나간 target protein 때문이다. 하지만 두 가지 step 모두 꼭 필요한 step이므로 resuspension, resin equilibrium을 보다 신경써 수행하여야 할 것이다.
5) 실험에 사용된 모든 buffer에는 NaPi(pH 7.4, Na2HPO4, NaH2PO4), 300 mM NaCl, 5 mM β-
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