생화학적검사(혈액검사와 소변검사, 헤마토크릿, 콜레스테롤측정, Bradford법을 이용한 단백질정량)

소개글

생화학적검사(혈액검사와 소변검사, 헤마토크릿, 콜레스테롤측정, Bradford법을 이용한 단백질정량)에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1소변검사, 혈액검사, 2헤마토크릿, 3단백질정량, 4Bradford, 5콜레스테롤

본문내용

이용하여 단백질 농도 그래프를 작성하고 오줌의 단백질 농도를 측정한다.
- Bradford법: 색소가 단백질의 염기성과 방향족 아미노산 측쇄와 결합하여 이를 흡광도 측정→단백질 정량 하는 방법
*시약 및 기재:
①Bradford 염료 시약 - Coomassie Brilliant Blus G-250 dye, phosphoric acid, methanol의 혼합물로써 혼합된 용액을 구입하여 사용한다. 사용 전에 이 염료 시약을 증류수로 5배 희석하여 여과한 후 유리용기에 담아 실온에서 보관한다. 이 희석용액은 2주간 안정하다.
②단백질 표준용액 - Bovine gamma globulin(또는 Bovine serum albumin)01mg/ml
③분광광도계
④큐벳
* 실험방법:
①표준 단백질 용액과 증류수를 섞는다.
②희석한 Bradford 염료 시약을 각 시험관에 첨가하여 잘 섞는다.
③5분간 방치한 후 1시간 이내 595nm에서 흡광도를 측정한다.
④흡광도들로부터 표준곡선을 그리고 미지시료의 농도를 결정한다.
*BSA(Bovine serum albumin) concentration= 0.1mg/ml =1ml 에 단백질량이 0.1mg
*실험결과
y의 값은 흡광도의 값이고 x의 값은 단백질 농도의 값이다.
단백질 정량법은 크게 5개로 분류할 수 있다.
1. Kheldahl 질소 정량법: 가장 많이 이용되는 방법
2. Bradford법
3. Bicinchoninic acid(BCA)법
4. Lowry법
5. 자외선 흡수법
1. Kheldahl질소 정량법
일정량의 시료에 진한 황산과 분해 촉진제를 가한 후 가열하면 분해 및 산화.환원이 동시에 일어나고, 시료에 포함되어 있던 질소는 일단 NH3로 변해서 황산과 반응하여(NH4)2SO4을 만들고 분해액 속에 남게 된다. (이때 탄수화물이나 지질 및 진한 황산 등도 같이 분해하여 유독한 CO, SO2, CO2 등을 발생하므로 조심하여 다루어야한다.) 분해액에 과잉의 알칼리를 가하여 수증기로 증류시키면 암모니아가 다시 방출되고 이 가스(NH3)를 일정량의 규정 농도의 황산 용액에 흡수시키고 남은 과잉의 산을 규정 알칼리 용액으로 역적정하면 전질소량을 산출할 수 있다. 한편 산화제로서 K2SO4를 가하면 온도가 높아짐에 따라 SO3가 생성되어 유기물의 분해를 더욱 촉진시킨다. 보통 총 질소량*질소계수(6.25)를 곱하여 단백질로 한다.
이방법은 혼탁 시료에서도 적용되나 비단백태 질소화합물의 제거, 구성아미노산에 따라 질소 함량의 변동으로 오차가 생긴다.
2. Bradford법
Coomassie Brillant Blue G-250이 단백질과 결합하여 붉은 색이 푸른 색으로 변하고 최대흡수파장이 495nm에서 595nm로 옮겨지는 것을 이용하여 단백질의 농도를 정량하는 방법이다. 이 방법은 2분안에 측정이 끝나므로 매우 신속한 방법으로 재현성이 높고 감도가 Lowry법에 비하여 매우 높다. K+, Na+, Mg++,(NH4)2SO4, polyphenol, 환원당 등에 영향을 받지 않으며 4000dalton이상의 펩티드나 단백질은 모두 측정할 수 있다. 비이온성 세척제(Triton X-100), sodium dodecyl sulfate 등에 영향을 받으나 그 양이 0.1%이내이면 무난하다. 석영큐벳과 반응을 하기 때문에 유리 또는 프라스틱의 큐벳를 사용해야 하며 단백질의 종류에 따라 표준검량곡선이 약간 달라질 수 있으므로 겸량곡선의 표준물질을 선택하는 것이 매우 중요하다.
3. Bicinchoninic acid(BCA)법
단백질이 알칼리 조건하에서 cupric ion(Cu++)을 cuprous ion(Cu+)으로 환원시키는 것을 이용한 방법이다. cuprious ion과 초록색의 BCA시약이 반응하여 연분홍색을 형성한다. 이 방법은 Lowry법보다 감도가 좋고 한 단계의 혼합과정뿐이므로 매우 쉽게 할 수 있는 방법이다. Lowry시약보다도 매우 안정하며 세척제나 완충용액의 염, 4M guanidine.HCl, 3M urea 드으이 영향을 받지 않는다. 반면 발색 정도가 시간에 따라 일정치 못하며 환원당이나 고농도의 황산암모니움 등이 있는 경우 영향을 받는다. 농도에 따라 흡광도의 감응도가 직선이 아닌 경우도 있다는 단점을 갖고 있다.
4. Lowry법
Biuret반응과 phenol시약의 환원정색반응을 병용한 방법이다. 먼저 단백질용액을 알칼리성 조건하에서 Cu++와 반응시킨 다음 Folin시약을 첨가한다. 그러면 Cu+에 의해 phosphate molybdenum acid-tugsten acid complex가 환원되어 파랗게 발색된다. 특정 범위는 0.2~2mg/ml정도이지만, 계면활성제 EDTA 등의 chelate제, DTT와 2-mercaptoethanol 등의 환원제를 시작하여 많은 물질에 의해 방해를 받는다. 이 방법은 감도가 높으나 조작이 약간 복잡하다. 발색은 단백질의 종류에 따라 변동되나 미지 시료의 경우는 주의를 할 것이다.
5. 자외선 흡수법
대부분의 단백질은 tyrosine, tryptophan이 함유되어 있기 때문에 이들 아미노산들의 의해 Beer's 법칙을 이용하면 280nm에서 최대 흡광도를 보여 주는 관계로부터 단백질을 정량할 수 있다. 한편 핵산(nucleic acid)는 280nm보다 260nm에서 강하게 흡수되므로 핵산의 영향을 배제하고 단백질의 양을 아래의 관계식을 이용하면 단백질의 양을 예상할 수 있을 것이다. 단백질(mg/ml)=1.45D280-0.76D260(D280: 280nm에서의 흡광도, D260:260nm에서의 흡광도. 또 다른 사람에의해 제안된 경험식으로 아래와 같이 표현하고 있다.
단백질(mg/ml)=1.55D280-0.76D26
*우리조의 실험결과가 정확하지 않았다. 흡광도가 정확하지 않게 나왔다. 24시간 동안 열심히 모은 오줌인데 좀 아쉽다.
단백질 정량법의 종류에 대해서 알게되었다. 피펫을 생물학 및 실험시간에 만져봤었는데 오랜만에 만지니까 새로웠다. 뇨의 단백질을 조사하면 영양상태를 판정할 수 있다. 총 단백질량이 22세 기준 6.0g/100ml이상이면 양호하다.

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