DNA prep & Luciferase assay & Realtime PCR

소개글

DNA prep & Luciferase assay & Realtime PCR에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Introduction
2. Meterial & Method
3. Result
4. Discussion
5. Reference

본문내용

479241
14.85178412
　
2.926944
-Real time PCR-
ct값
Target gene(CPT1)
Target gene(PPARa)
Reference Gene(b-actin)
Control(대조군)
27.85895
29.53164
16.37755
WY-14643(실험군)
27.93849
29.64599
16.87339
ct값
dCt(CPT1 - b-actin)
dCt(PPARa - b-actin)
　
　
　
Control(대조군)
11.4814
13.15409
WY-14643(실험군)
11.0651
12.7726
　
　
　
　
　
　
　
ct값
ddCt
　
Control(대조군)
11.4814-11.4814 = 0
13.15409-13.15409 = 0
WY-14643(실험군)
11.0651-11.4814 = -0.4163
12.7726-13.15409 = -0.38149
상대비율
2^(-ddCt)
　
Control(대조군)
2^(-0) = 1
2^(-0) = 1
WY-14643(실험군)
2^(0.4163) = 1.3345
2^(0.38140) = 1.3026
4. Discussion
-DNA precipitation-
DNA는 자외선 영역의 빛을 흡수하는 물질인데 그 중에서도 특히, 260nm에서 최대의 흡광도를 보인다. 반면 단백질은 280nm와 230nm에서 높은 흡광도를 보인다. 즉, 260/280nm와 260/230nm를 계산하는 이유는 추출한 DNA가 단백질에 오염되어있는가를 알아낼 수 있는 척도이기 때문이다. 230nm은 Phenol, EDTA, 유기물의 파장을 측정하고 260nm은 핵산을 이루는 nucleotide의 파장, 280nm은 트립신, 트립토판을 가지는 단백질의 파장을 측정하는 파장대이다. 260/280의 비율을 통한 DNA순도는 1.8~2.1 정도의 수치가 측정되었을 때 좋은 수치이고 이보다 낮게 측정 된다면 DNA의 용액 속에 단백질이 많이 포함되어 있거나 DNA를 elution한 buffer의 pH가 낮은 경우를 예상할 수 있다. 반면 높게 측정되었다면 RNA가 오염되었거나 DNA의 fragmentation의 문제점들을 예상할 수 있다. 260/230의 비율을 통한 DNA순도는 1.9~2.2 정도의 수치가 측정되었을 때 좋은 순도를 가진다고 말하고 이보다 낮게 측정 된다면 DNA추출 시 사용한 Phenol 또는 Glycogen등이 남은 경우라고 예상할 수 있다. PRL-TK에서 A260/A230은 1.619, A260/A280은 1.994이므로 260/230의 비율을 통한 DNA순도가 오염이 되었다는 것을 알 수 있는데 이는 DNA를 추출할 때 제대로 추출하지 않아 Phenol 또는 Glycogen등이 남았을 것이라고 예상된다. 반면 PPREa에서 A260/A230은 1.880, A260/A280은 1.817이므로 마찬가지로 260/230의 비율을 통한 DNA순도가 오염이 되었다고 예상되는데 그 값이 1.9에 수렴하므로 오염의 정도가 PRL-TK에 비해서는 심하지 않다고 추측된다. PPREa 역시 DNA을 추출할때 Phenol 또는 Glycogen등이 남은 경우라고 예상할 수 있다.
-Luciferase assay & Real-time PCR-
WY-14643는 PPARa의 agonist로 작용하며 PPARa는 간세포의 핵막에 존재하며 recepter인 동시에 전사인자로 작용한다. 즉 agonist인 WY-14643이 PPARa에 결합하면 PPARa이 막에서 빠져나와 핵으로 들어가서 전사인자로 작용하게 된다. 이 때 본 실험에서는 Fire fly luciferase를 포함한 vector에 PPRE promoter를 재조합한 vector를 사용했는데 이 때 전사인자로 작용을 하게 되는 PPARa가 PPRE를 인식하여 결합을 하게 되고 이로서 luciferase가 발현되어 빛을 내게 되는 것이다.
지금까지의 실험결과를 모두 종합해보았을 때 WY-14643은 먼저 PPRE promoter를 함유한 cell에서 luciferase를 발현시켜 빛을 낸 것으로 보아 WY-14643은 transcription factor로서 작용한다는 것을 알 수 있다. 또한 Real time PCR 실험결과에서 CPT1a와 PPARa의 mRNA의 발현량이 control보다 높게 나온 것으로 보아 WY-14643이 PPARa과 CPT1a의 mRNA 발현의 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 이로써 WY-14643은 fatty liver cell에서 전사인자로서 작용을 하여 PPARa와 CPT1a의 전사를 촉진해 mRNA 발현을 증가시키고 이로서 lipid metabolism 과정 중에서도 b-oxidation에 관여하는 PPARa와 CPT1a의 발현이 증가되어 결과적으로 WY-14643은 fatty liver를 해결하는 효능을 가진다고 말할 수 있다.
5. Reference
Reference 1 : http://dasan.sejong.ac.kr/~yjlee/3-3.htm
Reference 2 :
https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=5569048&cid=61233&categoryId=61233
Reference 3 :
https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=2691611&cid=60261&categoryId=60261
Reference 4 :
https://m.blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=and9244&logNo=130185387085&proxyReferer=https%3A%2F%2Fwww.google.co.kr%2F
Reference 5 : Geoffrey M.Cooper, Robert E. Hausman, 『세포학 분자적접근』6판, 2015, 월드사이언스, p.129
Reference 6 :
https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=5569270&cid=61233&categoryId=61233
Reference 7 : https://blog.naver.com/qwerty_0620/220875578751

키워드

생명과학,   DNA,   PCR,   luciferase,   세포학,   세포생물학,   세포실험,   Real time PCR