pQE-gfp PROTEIN의 CHARACTERIZATION (역가측정)

목차

제 1 장 서론

제 1 절 연구목적

제 2 절 연구배경
I. Characterization
1. pQE Vector
2. GFP (Green Flurescent Protein)
3. IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside)

II. Materials and Method
1. Cultuer condition
2. Agarose gel
2.1. 이론적 배경
2. 2. 제조 방법
3. Southern hybridization
3.1. 이론적 배경
3.2. 실험 방법
4. Western hybridization
4.1.1. SDS Polyacrylamide Gel electrophoresis
4.1.2. 이론적 배경
4.1.3. 실험방법
4.2.1. Western blotting
4.2.2. 이론적 배경
4.2.3 실험방법
5 ELASA
5.1. 이론적 배경
5.2. 실험방법

III. Results And Discussion
1. Gfp gene 확인
2. Southern hybridization
3 SDS-PAGE
4. Cell growth 측정 [4조의 실험결과]

ⅠⅤ 고찰

참고문헌 및 참고 인터넷사이트

본문내용

도가 높다는 것은 세포배양 상층액 중에 항원을 인식하는 항체가 존재하기 때문에 효소가 플라스틱 웰에 결합되어 있음을 의미하고 항원에 특이한 항체가 없는 웰에는 효소가 씻겨 나가므로 효소반응이 일어날 수 없다. 이로써 항원에 특이한 항체의 존재여부를 알 수 있다.
5.2. 실험방법
먼저 antigen+coating buffer를 96 well로 되어있는 plate에 well당 5ul씩 분주하였다. 이것을 4 O/N or 37 2hr동안 배양시켰다. 그 후에 상등액을 제거하고 blocking solution(0.1% BSA-PBS)을 well당 100ul씩 분주하였다. 이것을 4 에서 30-60min간 정치시켰다. 상등액을 제거하고 PBS로 3회 washing 하였다. Primary antibody를 0.05 Tween 20+PBST로 희석시킨 후, well당 50ul씩 분주하고 상온에서 30min간 정치하였다. 다시 PBS로 3회 washing 하였다. Secondary antibody를 PBST로 희석시킨 후 5ul씩 well에 분주하였고, 상온에서 30min간 정치하였다. PBS로 3회 washing 하였다. OPD(4mg)+phosphate-citrate(pH5.0) 10ul+H2O2 4을 각각 50ul씩 well에 분주하였고, 상온에서 약 15-30min간 정치시켰다. 마지막으로 2.5M H2SO4 50ul을 분주하였고, ELISA Reader로 492nm에서 측정하였다.
III. Results And Discussion
1. Gfp gene 확인
Figure 1. Gfp gene restriction
사진은 gfp gene restriction 결과이다. 첫 번째 lane은 HindⅢ와 BamHI으로 Restriction 한 PS44 marker이며 두 번째 Lane은 gfp를 EcoRI과 HindⅢ로 Restriction 한 것이다. gene size는 720bp로 제대로 Restriction 된 것을 확인 할 수 있었다. 각각 5ul씩 loading 하였다.
2. Southern hybridization
Figure 2. Southern hybridization
사진은 Southern hybridization하여 얻은 사진으로 전기영동으로 분리된 DNA fragment들을 agarose gel상의 위치대로 nitrocellulose filter나 nylon membrane으로 옮기는 작업인 Southern blotting을 수행한 후 찾고자 하는 염기서열 또는 그의 일부 DNA fragment에 방사능 동위원소 등으로 표지를 하는 Probe labelling을 통하여 얻어낸 것이다.
3 SDS-PAGE
Figure 3. SDS-PAGE
사진은 gfp를 denaturation시켜 단백질의 분자량에 의하여 이동 속도를 달리하여 분리시키는 SDS-PAGE의 결과로 얻은 사진이다. 모두 시간은 동일하게 배양했으며 접종한 균의 비율을 다르게 하였다. 첫 번째 lane은 marker이며 두 번째 lane은 균과 배지의 비율을 1:99로 한 것이며 세 번째 lane은 균과 배지의 비율을 1:1로 하여 loading 한 것이다. 위 실험의 결과로 보아 배지에 비해 균의 수가 많을수록 더 효율이 높은 것으로 나타났다.
4. Cell growth 측정 [4조의 실험결과]
Cell growht 원심분리후의 wet weight를 확인함으로서 측정한다.(IPTG 농도는 0.3으로 동일하게 실행하였다.)
induction time
8hr
12hr
culture : medium
1:24
1:49
1:24
1:49
wet weight(g)
0.3
0.2
0.2
0.2
Cell growth
Fig-4 SDS PAGE
M: maker
control: blank
1. 24:1 8시간 배양
2. 49:1 8시간 배양
3. 24:1 12시간 배양
4. 49:1 12시간 배양
본래 IPTG는 Cell의 성장을 방해하지 않는다고 알려져 있다. 따라서 wet weight 값은 모든 실험군에서 비슷하거나 동일 할 것이다. 이런 가정하에서 우리조는 IPTG의 농도는 0.3으로 일정하게 유지한체로 접종비율과 배양시간의 차이만으로 성장률을 측정하였다.
결과상으로 보면 24:1의 접종비율과 배양시간이 8시간일때 가장 높은 성장률을 보였으며, 나머지 조건일시에는 성장률이 비슷하였다.
두 번째 maker는 blank로 33Kd에서 가장 흐린 것을 볼 수 있다. Lane 3의 경우 culture:medium의 농도를 1:24로 하여 12시간동안 배양한 것으로 Lane 1,2,4보다 흐린 것을 볼 수 있다. 아래 결과를 봤을 때, 배양시간을 8시간으로 했을 때는 culture:medium의 농도를 1:24로 했을 경우 GFP의 생산이 더 효율적이였으며, 배양시간을 12시간으로 했을 때, culture : medium의 농도를 1:49로 했을 경우 GFP 생산에 더 효율적 이였음을 볼 수 있다.
ⅠⅤ 고찰
한 학기 동안 이루어진 유전학 실험은 그 결과에 목적을 두고 있지만, 생물학도로서의 기본적인 역량을 갖추는 데 더 큰 의미를 두었다.
우리의 현대의 연구과제들은 작은 원핵생물의 연구가 아닌 휴먼 게놈프로젝트를 위한 중요한 연구문제에 직면하고 있다. 하지만 인간의 DNA는 상당히 목잡하고 어렵기 때문에 염기서열이 비교적 단순한 박테리아를 사용하고 있다. 게놈프로젝트의 중요성은 그 연구의 규모에 있어서 그 중요성을 말해주고 있다.
본 실험은 본인이 현 시대흐름에 함께 나아가기 위한 시작점에서 시작한 일보의 시작으로서의 단계이다.
참고문헌 및 참고 인터넷사이트
1. 윤병수 (1999) 분자생물학 연구방법론 II. 경기대학교
2. 분자생물학노트 3판. 1998. 대표저자 이대실 외 22명 저.
Kist 생명공학연구소 발행.(일반적 실험법)
3. Morelle, G. (1988) Aplasmide extraction procedure on miniprepscale.
Focus 11, 7.
4. 유전자 크로닝 입문 제 3 판. 대표저자 강종백 외 2명 저, 월드 사이언스
5. www. Qiagen. com

키워드

분자생물학,   유전학,   CHARACTERIZATION,   PROTEIN,   gene,   클로닝,   실험논문