PCR과 전기영동

소개글

PCR과 전기영동에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 실험 제목

2. 실험 목적

3. 이론 및 원리
(1) PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응)
1) 원리
2) 방법
3) 프라이머(Primer)
4) DNA 중합효소
5) PCR의 이용
(2) 전기영동(Electrophoresis)
1) 전기영동의 원리
2) 전기영동의 매질
3) 전기영동의 기구
4) 전기영동의 다양성
5) 전기영동의 방법
6) 핵산의 검출

4. 실험방법

5. 실험기구 및 시약

6. 참고문헌

본문내용

bocyanine 또한 많이 이용되며 이 시약 은 RNA는 푸르스름한 자줏빛으로 DNA는 푸른색으로 염색시킨다.
Agarose gel의 농도와 DNA의 분리 범위
<참고>
# 써던블롯(Southern blotting)
써던(E.M. Southern)은 1975년에 특정한 DNA 단편을 확인할 수 있는 방법을 발표했는데 이 방 법으로 복잡한 DNA 혼합물에서 원하는 특정유전자를 분리할 수 있다. 써던블롯법은 핵산의 염기 상보성 특이성을 이용한 방법이다. 먼저 아가로스 젤 전기영동으로 DNA 단편을 크기별로 분리한 다. 그 다음 DNA 단편을 단일가닥이 되도록 변성(denature)시키고 니트로셀룰로즈 필터 (nitrocellulose filter)나 나일론 막(nylon membrane)으로 옮기면 젤 상에서의 위치대로 필터에 단 단하게 결합된다. 완충용액이 젤과 막을 통해 흐르면서 DNA가 옮겨지는데 음전하를 띤 DNA 단 편을 전기영동법을 이용해 젤에서 막으로 옮길 수도 있다. 필터는 방사능 탐침(probe)이 있는 용 액에 담근다. 이때 탐침은 방사성 동위원소로 표지된 핵산조각으로 상보성 DNA 단편과 혼성화(h ybridize)하여 그 위치를 결정할 수 있다. 탐침에 상보적인 DNA 단편은 방사능을 띠게 되고 방 사능사진법(autoradiography)으로 쉽게 확인할 수 있다. 이 기술에서는 사진필름을 필터 위에 몇 시간 덮어놓은 다음 현상하는데 동위원소에서 나오는 에너지가 어두운 은색 입자를 형성하기 때 문에 방사능을 띤 DNA 단편에 노출된 곳마다 필름이 검게 변한다. 써던블롯법을 이용하면 복잡 한 혼합물에서 원하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을 탐지, 분리할 수 있다.
4. 실험방법
1) 다음 성분을 0.5㎖의 소형 튜브에 넣는다.
① 10 PCR 완충액 5㎕
② 2mM dNTP 5㎕
③ 프라이머 1(25p㏖/㎕) 1㎕
④ 프라이머 2(25p㏖/㎕) 1㎕
⑤ 주형 DNA(약 1㎕ genome DNA)
⑥ 이상의 반응액 총량이 47.5㎕가 되도록 초순수를 가한다.
각 성분을 분취할 경우는 새로운 팁을 사용한다. 복수의 반응을 1회에 수행할 경우는 적당한 성 분을 미리 혼합 시켜두면 피펫팅 횟수를 줄일 수 있고, 오염을 방지할 수가 있다. 주형 DNA 또는 프라이머를 넣지 않은 대조구의 소형 튜브를 동일하게 처리해 두는 것을 잊지 말아야 한다.
2) 시약을 분취한 뒤에 소형 튜브를 소형 원심분리기에 1초간 원심분리하여 혼합하고, 얼음에서 냉 각시킨다.
3) 0.5㎕ Taq 중합효소(5U/㎕)를 반응액에 넣는다.
4) 50㎕의 미네랄 오일을 소형 튜브의 액면에 가하여, 가온 단계에서 반응액이 증발되는 것을 방지 한다. 미네랄 오일을 사용하지 않는 thermal cycler를 사용할 경우에는 생략한다.
5) 소형 튜브를 thermal cycler에 세트시키고, 다음과 같이 지정된 온도를 반복시키는 프로그램을 실행한다.
① 94 . 1분(DNA 변성 : 초기가열)
<증폭 사이클>
② 94 . 1분(DNA 변성)
③ 55 . 1분(주형 DNA와 프라이머의 annealing : annealing)
④ 72 . 1분(DNA 중합효소에 의한 프라이머 신장 : 신장반응)
②∼④의 증폭 사이클을 20∼30회 반복 수행한다.
⑤ 72 . 2분(DNA의 합성이 완결되도록 확인반응 : 추가 신장반응)
②∼④의 사이클 수는 주형 DNA의 상태와 양에 의존된다. 일반적으로 genome DNA를 주형 으로 할때는 30∼35사이클 후에 5㎕ 정도의 반응액을 취하고, 40사이클 실행시킨 시료와 함께 증폭된 밴드를 비교하여 결과를 판단한다.
6) 반응이 종료된 뒤, 반응액을 thermal cycler에 놓아둔 채로 다음의 조작을 실행하기까지 온도는 실온이나 4 로 유지해 둔다. 그러나 thermal block의 수명을 연장시키기 위해 매번 반응액의 온 도를 4 로 유지할 필요는 없다.
7) Thermal cycler에서 반응에 사용한 소형 튜브를 꺼낸다. 만약 미네랄 오일이 과잉으로 들어있는 시료는 팁을 주의 깊게 미네랄 오일 하층의 반응액까지 넣어서 약 45㎕의 반응액을 들어낸다. 이 때 미네랄 오일은 절대 섞이지 않도록 한다.
8) 팁의 외측에 묻어있는 미네랄 오일은 닦아내고 반응액을 새 소형 튜브에 넣는다.
9) 5∼15㎕의 시료를 아가로스 겔 전기영동으로 분석한다. 이때는 반드시 DNA 마커를 동시에 영 동하는 것을 잊어서는 안 된다.
5. 실험기구 및 시약
1) 실험 기구 : 소형 냉동 원심분리기, Thermal cycler, 겔 전기 영동장치, 마이크로피펫, 팁,
소형 튜브
2) 재료와 시약
① 내열성 DNA 중합효소(TaqDNA 중합효소)와 완충액
② 2mM dNTP 혼합액
③ 프라이머(Oligo deoxynucleotide primer)
④ 주형 DNA
⑤ 0.8% 아가로스(TAE 완충액 100㎖ 중에 0.8g의 아가로스를 녹인 것)
⑥ 50 TAE 완충액
⑦ 10 PCR 완충액
6. 참고문헌
Ⅰ. 서적
1. 미생물학실험서. 한국미생물학회. 을유문화사. 1998, pp485∼492.
2. 생화학. D.L. Nelson, M.M. Cox 저. 박길홍 외 8인 역. 서울외국서적. 2002, pp136∼138, pp116 1∼1163.
3. 유전공학(제2판). J.D. Watson 외 3인 저. 박영순 외 5인 역. 탐구당. 2002, pp87∼93.
4. 유전공학개론. 김재호, 장혜영. 靑文閣. 2001, pp81∼82, pp105∼112.
5. 유전자감식. DNA프로필연구회. 탐구당. 2001, pp28∼30, pp33∼36, pp38∼41.
6. 일반미생물학. L.M. Prescott, J.P. Harley, D.A. Klein 저. 김경민 외 6인 역. 라이프사이언스. 2003, pp296∼299.
7. PCR 실험노트. Taketoshi Taniguchi 저. 지성길 역. 월드사이언스. 2002, pp12∼27.
8. PCR 실험의 원리와 응용. 최용락, 정수열, 이영춘. 세종출판사. 2003, pp1∼18, pp24∼27, pp23 1∼232.

키워드

PCR,   전기영동,   써던블롯,   겔,   DNA