미생물 성장 분석실험

본문내용

, colony counter
2) 시 약 : Nacl, yeast extract, tripton pepton, agar, glucose
3) Glucose kit
배지 내의 glucose를 glucose oxidase에 의해 glucoic acid와 과산화수소로 분 해 한 뒤 과산화수소 효소를 작용시킴으로써 과산화수소가 발색 원과 반응하 여 생성되는 비색을 정량하는 원리로 제작된 포도당 측정용 시약을 사용하여 실험한 후 505㎚에서 박색 시약을 대조로 흡광도를 측정
4) Media for bacterial culture
Agar plate
Cell culture
Glucose media
Nacl 10g/L
Nacl 10g/L
Glucose 20g/L
Yeast extract 5g/L
Yeast extract 5g/L
Nacl 10g/L
Tripton pepton 10g/L
Tripton pepton 10g/L
Yeast extract 5g/L
Agar 15%
Tripton pepton 10g/L
Table 3.1 Media for bacterial culture
3. 2 실험방법
1) Agar plate / culture broth
Agar plate : Nacl(10g/L), Yeast extract(5g/L), Tripton pepton(10g/L), Agar(15%) : Autoclave 121˚C/15min
Culture broth : Nacl(10g/L), Yeast extract(5g/L), Tripton pepton(10g/L) or Glucose(20g/L) : Autoclave 121˚C/15min
2) Optical density
(1) 파장을 505㎚ or 600㎚에 맞추고 샘플의 optical density를 읽는다. 눈금을 읽 기전에 정확한 값을 얻기 위해 spectrophotometer를 최소 15분 동안 warming up을 한다.
(2) 파장을 505㎚ or 600㎚에 맞춘다.
(3) 물이 들어 있는 cuvette을 기계에 넣고 영점을 맞춘다.
(4) 매 5분마다 샘플이 들어있는 cuvette을 기계에 넣고 optical density를 읽는다.
3) Glucose via cell mass
모든 작업은 clean bench안에서 이루어 져야 한다. sampling시간에 맞추어 flask 에서 얻은 100㎛와 DW 900㎛를 골고루 섞은 뒤 cuvette에 넣어 흡광도를 측정 한다. 매 20분 간격으로 OD 600㎛에서 흡광도를 측정한다. 동시에 glucose 농도 를 측정하기 위해 1.5㎖ 튜브에 200㎕를 따로 얻은 뒤 10000rpm/5min centrifuge 이후 상등 액을 다른 튜브에 옮겨 냉장온도에서 보관한다. standard curve 작성할 때와 동일한 방법으로 배지에서 존재하는 포도당의 양을 측정한 다.
4) Serial dilution
(1) 0.9㎖ media가 포함된 6개의 test tube를 준비한다.
(2) 멸균된 tip과 함께 pipette을 이용 삼각플라스크로부터 0.1㎖ sampling을 한 후 tube 1 에 담는다. 같은 방법으로 tube1에서 tube6까지 dilution을 한다.
(3) 10만큼 희석된 6번째 tube에서 0.1㎖를 sampling해서 incubation을 한다.
(4) 도말 봉으로 sample을 spreading 한 다음 마를 때까지 기다린다.
(5) sample이 다마르면 37˚C incubator에서 하루 동안 incubation을 한다.
(6) 하루가 지난 후 생성된 colony수를 센다.
4. 실험결과
1) Glucose via cell mass
완충액(㎕)
2
4
6
8
10
20
기준액(㎖)
1
1
1
1
1
1
파 장(㎚)
0.070
0.172
0.225
0.292
0.365
0.754
Table 4.1 Glucose via cell mass
2) Microbial growth curve
시 간(min)
20
40
60
80
파 장(nm)
0.707
0.664
0.701
0.720
Table 4.2 Microbial growth curve
3) Glucose consumption curve600
시간(min)
20
40
60
80
파장(㎚)
1.192
1.244
1.242
1.239
Table 4.3 Glucose consumption curve
4) Cell growth estimation
Dilution
10³
10⁴
10
10
10
colonies(개)
733
96
22
18
24
Table 4.4 Cell growth estimation
5. 토의 및 결론
이번 실험은 목적은 미생물을 직접배양해보고 그에 따른 생장곡선을 그려봄으로써 실험으로 얻어지는 실험값이 우리가 이미 알고 있는 Microbial growth curve와 어느정도 일치하는가를 알아보고 그와 다르다면 실험환경에서 어떠한 조건이 그런 결과를 가지고 왔는지 알아볼수 있다. Fig 4.1에서 알수 있듯이 cell mass는 천천히 증가하다가 일정한 시간이 되면 급격하게 그 수가 증가하는 것을 알수 있다 이는 우리가 알고 있는 lag phase와 exponential phase까지의 생장곡선과 일치한다. 실험시간의 제약으로 인해 20분 단위 간격으로 설정했지만 실험시간을 길게 가지고 간다면 우리가 알고 있는 stationary phase나 cell death phase까지도 관찰이 가능할수 있음을 알수 있다. 그리고 Fig 4.3에서 얻은 시간에 따른 glucose consumption curve는 우리가 알고 있는 미생물학적인 지식에 의하면 그 값이 미생물에 생장에 따라 초기에는 감소하다가 일정단계까지 미생물이 생장한단계에 이르면 glucose의 농도는 증가해야 하지만 이번실험에서는 기타 실험조건이 이상적인 조건과 일치하지 않아 그와 다른 curve를 얻게 되었다.
이와 같은 실험오차값을 통하여 미생물의 생장에 있어 PH, 배지조건, 온도 등의 조건이 큰 영향을 가지다 줄 수 있음을 알수 있다. 그러므로 이러한 조건의 차이를 둠으로써 우리가 얻고 싶은 미생물을 얻을수 있음을 알수 있다.

키워드

미생물,   microbial,   미생물성장분석