Real-time PCR (실시간 중합효소연쇄반응)

본문내용

용하기 때문에 광범위의 발광파장(예로 400~600 ㎚)을 흡수할 수 있는 비형광성 소광물질이 필요하다. 구아노신의 전자 주는 성질 때문에 이 물질은 이상적인 소광제이고 실제로 이용된다.
근년에는 다발광 다이오드나 넓은 파장범위를 방출하는 텅스텐 광원을 사용한다. 고성능의 광여과기를 사용한 경우에는 현대의 많은 검출장치를 이용할 수 있다. 이런 장치로도 4색 올리고탐침만 사용할 수 있다.
최근에, 공증폭을 할 수 있고 또한 2개 이상의 형광물질을 분별할 수 있는 진단용 미생물 분석 방법은 손에 꼽을 정도이다. 이 분야는 앞으로 소프트웨어와 기술상의 발전이 필요하다.
미생물학에의 응용
실시간 PCR분석법은 전염성 질병의 세균을 연구하는 데 매우 유용한 방법이다. 이 방법은 질병의 진행과정을 밝히는 데 큰 도움이 되었다. 문헌에 나타나는 이 방법의 대다수가 비PCR 방법에 비해 많이 증가하고 있다. 또한 실시간 PCR은 미생물학 기초연구에도 유용하다는 것이 증명되었다. 많은 형태의 시료로부터 얻은 주형들을 증폭할 수 있는 능력이 미생물학의 연구에 이용된다.
바이러스
- 실시간 PCR의 응용은 바이러스의 연구에 가장 큰 영향을 주었다. 일련의 인간 질병에서의 바이러스의 역할을 연구하고 또한 핵산의 양을 측정하여 여러 가지 바이러스의 동시 감염에 의한 전염병 연구에 많은 진전을 이뤘다.
- 많은 연구에서 PCR은 바이러스의 검출에 사용되며 또한 감염의 정도, 바이러스와 숙주와의 상호작용 그리고 항바이러스 치료의 결과로 바이러스에 생기는 변화를 연구하는데 매우 유용하게 쓰인다. 질병의 정도와 바이러스의 양은 서로 연관되기 때문에 실시간 PCR 정량은 질병의 진행과정에서 바이러스의 재활성화나 내성의 역할을 연구할 때 매우 유익하다. 바이러스의 지향성이나 복제상의 변화 및 이런 변화가 숙주세포에 주는 효과는 실시간 PCR를 사용하여 조사할 수 있다.
- 높은 감도와 신속한 실시간 PCR법은 바이러스 유전자 치료용 운반체의 분석에 사용된다. 또한 새로 출현하는 바이러스에 관한 연구는 실시간 PCR을 사용하여 특별한 바이러스의 염기서열과 환자가 느끼는 여러 가지 증상과의 상호관계를 증명하였다.
박테리아
- 실시간 PCR은 전통적 배양법이나 조직화학적 방법들을 대체할 수 있다. 특히 긴 배양시간을 신속한 유전자 검출로 대체할 수 있을 때, 특정한 박테리아 종들은 실시간 PCR 분석용으로 더 자주 주목을 받는다. 몇 종의 박테리아는 실시간 PCR을 사용하여 검출하고 또한 정량하였다.
- 여러 가지 박테리아 중에서 항생제에 대한 내성을 검사하는데 실시간 PCR가 이용된다. 또한 뇌막염과 패혈증과 같은 급성질환과 박테리아에 의한 식중독에 관한 이해가 이 방법에 의해 많이 증진되었다. 치주 질환의 발생에 트레포네마균이 관여한다는 것이 밝혀졌다.
- 최근에 실시간 PCR가 생물전쟁에 쓰이는 미생물의 신속한 검출에 쓰일 수 있다는 논문들이 폭발적으로 나타나고 있다.
균류, 기생충 및 원생동물
- 균류, 기생충 및 원생동물의 연구에 이용한 예는 대단히 적다. 그러나 실시간 PCR은 Aspergillus fumigatus등의 감염의 진단에 많이 기여하였다. 이 실시간 분석은 Stachybotrys Chartarum과 같은 독소를 발생하는 균류의 포자를 연구할 때 이용되었다.
- Toxoplasma gondii의 혈청 시험은 재래식 방법에서 시간이 많이 걸렸다. 그러나 실시간 PCR은 이 미생물의 검출방법을 많이 개선하였다. 이외에도 이 방법은 항미생물 치료에 대한 T. gondii의 반응을 연구하는데 이용된다.
- 모델 쥐와 실시간 PCR을 같이 사용한 말라리아 기생충의 검출시험은 좋은 결과를 얻었고 이것은 기생충에 관한 자료를 얻을 수 있음을 뜻한다. 실시간 PCR가 높은 감도로 생체내 실험으로 말라리아 기생충의 검출과 정량에 이용할 수 있다는 것이 증명되었다.
PCR의 신속성과 높은 감도는 미생물학에 가장 이상적으로 혜택을 줄 수 있다. 또한 실시간 PCR의 출현은 많은 일을 해야 하는 환경에서 PCR의 역할을 더 증진시켰다. 불행하게도 많은 유전자형 분석은 복잡한 인간유전학의 분야에서 처음으로 시도되었다.
형광물질, 뉴클레오타이드의 표지 및 올리고탐침 혼성체화의 발전은 실시간 PCR의 유용성을 확대시켰다. 신속한 Thermal cycler와 증폭물을 분리하고 검출하는 기기들로 인해서 실시간 PCR은 매일의 진단실험에서 매력 있고 실용적인 위치로 올려졌다. 많은 실험실들은 전염성 질병의 미생물을 분리하기 위해서 조직배양에 의존하고 있다. 그러나 이런 방법은 미지의 병원균에 관한 정보를 제공하지만 너무 많은 시간이 소요된다.
가장 널리 사용되는 형광성 탐침은 5‘핵산가수분해효소 올리고탐침이다. 다른 방법으로는 한 쌍의 HybProbes와 LightCycler를 사용한 방법들이 특히 미생물의 검출과 유전자형 분석에서 중요해지고 있다. 또한 바이러스-검출용 실시간 PCR가 다른 미생물 분야보다 더 많이 문헌에서 찾아볼 수 있다.
다중 실시간 PCR의 최근의 발전은 하나의 반응용액에서 미생물 표적의 쉬운 동정, 유전자형 분석 및 정량의 보편화를 예상케 한다. 실시간 PCR은 미생물학에서만 한정되는 것이 아니고 인간 유전자 진단에서 이룩한 중요한 업적들과 같이 유전병의 검출에 이용될 것이다. 그러나 이 방법은 컨트롤과 사용한 프로그램에 따라 신뢰도가 결정된다. 여기에는 표준시료의 품질, 잘 조절된 표준곡선의 사용 및 모든 분석에 대해서 최적조건을 맞추고 정당성을 입증하고 그리고 공정한 평가를 해야 하는 필요조건들이 포함된다. 이런 배려가 없다면 실시간 PCR은 신속하지만 정확치 못한 자료를 제공하게 된다. 상업적 흥미는 의심할 여지없이 어느 기술이 주류가 될 것인지를 결정하는데 큰 역할을 할 것이다.
앞으로 micro 및 macroarray 기술과 미세유체용 장치들이 결합하면, 원하는 만큼의 많은 표적들을 분간할 수 있고 또한 대단히 빠른 속도로 정량적 자료를 얻을 수 있게 하는 실시간 PCR은 미래의 실험실을 위해서 일상적이고 강력한 도구로서 형광성 핵산의 증폭에 이용될 것으로 예상된다.

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