PCR (polymerase chain reaction)과 DNA replication

목차

1. DNA replication
1) DNA복제의 일반적인 특징
2) 복제 과정
3) DNA복제의 충실성: Proofreading

2. PCR (polymerase chain reaction)
1) 원리
2) 특징
3) 방법
4) PCR의 재료 및 주의 할점
5) PCR의 이용

본문내용

수행하였을 때의 생산물을 말한다. 프라이머 이량체는 한쪽 또는 양방향의 프라이머의 염기서열과 거기에 상보적인 염기서열을 가지고 있고, 그것이 PCR에 의한 증폭이 되기 쉬운 주형이 된다. 작은 분자는 보다 효과적으로 증폭되므로 그것이 PCR의 생산물의 대부분을 접하게 되고, 목적하는 주형 DNA상의 프라이머로서의 역할을 다하지 못하게 된다.
- 프라이머의 조건
많은 경우 프라이머의 염기서열은 주형 DNA와 완벽히 상보적일 필요는 없다. 그러나 프라이머의 3`-말단은 주형 DNA에 완전히 상보적일 필요가 있다. 왜냐하면, 3`-말단에서DNA 중합효소에 의한 합성반응이 개시되어지기 때문이다. 일반적으로 적어도 3`-말단의 3뉴클레오타이드는 완전히 상보적이지 않으면 안 된다. 한편, 프라이머의 5`-말단은 주형DNA에 완전하게 상보적일 필요는 없다. 이러한 것은 염기서열을 변화시킴으로서 PCR 생산물에 변이를 도입시키고, 클론화를 용이하게 하거나, 발현을 용이하게 하고, 제한효소 절단부위를 도입시키게 하는 목적을 위해서는 좋다.
⑦ DNA 중합효소
중합효소반응이 연쇄적으로 일어나기 위해서는 첫 번째 싸이클에서 복제된 DNA가 변성되고 프라이머와 샘플 DNA가 다시 보합할 수 있어야 한다. 이중나선을 단일나선으로 변성시키는 방법은 여러 가지가 있지만 90℃이상의 고온으로 가열하는 것이 가장 간편한 방법이다. 그러나 중합효소를 포함한 대부분의 효소들은 이보다 훨씬 낮은 온도에서도 활성을 잃고 한번 활성을 잃으면 되살아나지 못한다. PCR이 성공할 수 있었던 것은 1984년 열에 잘 견디는 중합효소가 얻어졌기 때문이다. 원래 PCR에는 대장균 DNA 중합효소를 사용하였는데, 이 효소는 열에 민감하여 이중사슬 DNA를 분리하는데 사용한 온도에서는 그 기능을 잃어버린다. 그러므로 신선한 효소를 매 주기마다 첨가해야만 하는 지루한 과정이었다. 그러나 미국 옐로스톤 국립공원의 온천에서 사는 박테리아가 높은 온도에서도 작용하는 DNA 중합효소를 가지고 있다는 사실의 발견으로 중요한 기술상의 진보를 가져왔다. 최초의 내열성 중하효소를 추출한 균주의 학명은 Thermus aquaticus이며 이 균으로부터 추출된 DNA 중합효소는 그 머리글자를 따서 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase), (Taq 또는 Taq 중합효소로 부름)라고 명명되었다. Thermus aquaticus 박테리아는 75℃의 물에서 산다. 이 DNA 중합효소(Taq 중합효소)의 적정온도는 72℃나 94℃에서 상당기간 안정하다. Taq 중합효소는 반응 초반에 한 번 넣으면 증폭주기 전 기간동안 활성을 유지한다. Thermococcus litoralis에서 나온 벤트 중합효소(Vent polymerase)도 이용되고 있다.
PCR을 위한 시간과 온도주기가 프로그램 되어진 가열대를 지닌 열주기계 (thermal cycler)를 사용하게 됨으로써 PCR의 자동화가 개발되었다. PCR을 위한 재료를 열주기계에 넣기만 하면 반응은 아무런 인력의 개입 없이 일어난다. PCR의 특이성과 감수성은 Taq 중합효소에 의해 개선되었다. 대장균 DNA 중합효소가 작용하는 낮은 온도에서는 프라이머가 표적 염기서열과 약간 다른 염기서열이 있는 위치에서 결합할 수 있다. 잘못 짝지워진 프라이머가 DNA의 반대편 사슬에 가까워졌을 때 증폭이 일어날 수 있다. 프라이머와 정확한 상보적 염기서열이 합성된 절편에 포함되기 때문에 프라이머와 정확하게 짝지워지는 끝을 가진 필요치 않은 염기서열이 만들어진다. 이와 같은 PCR의 초기 주기에서 합성되어진 부정확한 절편은 계속되는 주기에 효과적으로 증폭되어질 수 있다. 반면에, 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 원하지 않는 부위와의 결합은 Taq 중합효소에 작용하는 온도에서는 유의할 정도로 낮아진다. 결과적으로 표적 염기서열 이외의 다른 서열의 증폭은 없다.
5) PCR의 이용
PCR기술은 분자생물학, 의학, 생물공학 등 여러 분야에서 매우 중요한 기술이다.
→PCR을 이용해 아주 적은 양의 특정 DNA를 서열분석이나 일반적인 클로닝을 할 수 있는 충분한 양으로 증폭시킬 수 있다. DNA 절편이 증폭된 것은 다른 염기순서들에 비해 본 수 가 수십만 배 이상 많기 때문에 클로닝하는 것이 매우 쉽다. 그리고 원리적으로는 단 한 개의 염기순서만 있더라도 그 염기 순서를 증폭해서 얼마든지 볼 수 있고 얻을 수 있다. 이것은 단 한 마리의 세균도 찾을 수 있다는 것이고 수억 년 전 공룡의 DNA도 클론 할 수 있다는 말이며 한 개의 정자를 가지고 사람을 구분해 내는 것도 가능 하다는 것을 뜻한다.
- PCR의 이용
① 질병의 진단
: PCR 기술에 근거하여 에이즈 (AIDS), 라임병 (Lyme disease), 클라미디아 (chlamydia), 결핵, 간염, 인간 파필로마바이러스 (human papilloma virus) 및 다른질병을 진단할 수 있는 측정법이 개발되고 있다. 이 측정법은 빠르고 민감하며 특이적이다. PCR은 낫세포빈혈증 (sickel cell anemia), 페닐케톤뇨증(phenyketourea), 근육위축병(muscular dystrophy)과 같은 유전질환을 진단하는데 특히 유용하다.
② 범죄현장에서의 이용
: PCR은 DNA 지문법의 일부분으로 범죄사건을 수사 하는 법의학분야에 큰 영향을 미치고 있다. 범죄현장에서 발견된 아주 적은 양의 생물시료를 이용해 용의자를 가려내거나 유죄를 확인할 수 있다.
위에서 본 것과 같이 DNA replication과 PCR은 거의 동일한 과정을 거친다. 하지만 DNA replication 은 생체 내에서 잘 갖추어진 조건과 다양한 효소들에 의해 정확하게 복제가 이루어지는 반면, PCR은 DNA 복제과정을 이용한 실험 방법이긴 하나 생체내의 조건이 없는 외부환경에서 필요한 여러 가지 요소들을 첨가해 주어야 한다는 점에서 매우 중요한 차이를 보인다.
위 내용에서 DNA 복제 시 작용하는 다양한 효소들의 기능과 PCR의 원리와 이 과정 에서 사용되어지는 구성요소들의 기능 등을 이해하는 것을 주요 목적으로 삼았으면 하는 바램이다.

키워드

PCR,   DNA replication,   복제효소