Knock out method를 통한 Synechocystics sp. PCC 6803 의 target gene function 규명

소개글

Knock out method를 통한 Synechocystics sp. PCC 6803 의 target gene function 규명에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Introduction
Knock out method 에 관한 조사
2. Materials & Methods
3. Result
4. Discussion
5. Note
6. reference

본문내용

만큼 rpm, 조작법 등이 다르다. 일반적인 PCR은 tube를 꽂은 well 하나하나의 온도가 올라갔다 내려갔다를 반복한다. 그러나 gradient PCR은 well 하나하나의 온도가 달라 조건을 다르게 setting해야 해서 몇 도가 최적인지를 모르는 단점이 있다.
PCR을 시행할 때 가장 중요한 것은 balance를 맞추는 것이다. 마주보는 tube끼리의 무게를 맞춰주면 되는데, 이것을 간과하면 큰 사고가 날 수 있다. PCR의 시간과 온도를 입력하는데, 우리는 온도를 25℃에 맞추었다. 이것은 cyanobacteria가 그 이하의 온도에서는 stress를 받기 때문이다. 모든 절차가 끝나고 PCR을 작동시키면 rpm이 올라가고 cell이 down되어 pellet을 얻을 수 있다.
PCR을 돌린 후 전기영동을 실시하면 그 결과가 다양하게 나타날 수 있다(실험 중에 넣어주는 것들이 많아 변수가 많아지게 된다). 첫 번째로, band가 안 나타날 수 있다. 이것은 여러 요인을 생각해볼 수 있는데, primer TM값이 너무 높거나 낮아서, 또는 forward, reverse primer 2개가 서로 반응했기 때문에, 또는 hair-pin 구조가 형성 되었기 때문으로 추측할 수 있다(주형이 결과에 영향을 미치므로 잘 만드는 것이 중요하다). 두 번째로, 여러 개의 band가 나타날 수 있다. 이것은 specific binding이 이루어지지 않았기 때문이다(annealing 시기에 온도를 높여줌으로써 해결할 수 있다).
5. Note
▶ agarose gel을 만들 때 EtBr을 넣으면 염색과정이 필요 없다.
장 점
단 점
절차가 간소해 진다.
전기영동시 UV를 비춰 DNA의 이동을 바로 확인할 수 있다.
DNA의 이동속도가 15% 늦어진다.
전기영동시 EtBr이 없으면 Sharp한 band를 얻을 수 있다.
DNA의 형태에 따라 EtBr의 결합정도가 달라져서 natural한 pattern을 보기 어렵다.
전기영동 tank 및 gel tray가 EtBr에 오염된다.
단, 그 차이는 그리 크지 않으므로 실험실마다 선호하는 방법이 다르다.
▶ PCR이 이용되는 실험
- probe로 사용할 목적으로 cloning된 이중가닥 DNA의 증폭
- 적은 양의 mRNA로부터 특정 cDNA의 cloning
- DNA sequencing, -돌연변이 검사
- 병인성 바이러스 및 박테리아 검출
- 유전자의 footprinting
- 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 유전자의 제조(site directed mutagenesis)
▶ PCR의 의학적 응용
- HLA형의 결정
- 법의학 : 특정인의 유전자 검출
- 암유전자의 검출 : ras, myc, fos 등
- 유전성 질병의 진단: Progressive muscular dystrophy(Duchenne type)등
- 감염성 질병의 진단: Streptococcus, Salmonella, Hepatitis virus 등
6. reference
http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_13.php
http://blog.naver.com/jagiya97?Redirect=Log&logNo=120003093255
http://blog.naver.com/lkh0426?Redirect=Log&logNo=100037122152
http://kin.naver.com/db/detail.php?d1id=11&dir_id=110205&eid=42eFjPzxqqEtuGoYOjtYgn6uRmu/RuaN& qb=QnJvbW9waGVub2wgYmx1ZSBkeWU=

키워드

Knock out method,   Cyanobacteria ,   vector,   Taq DNA polymerase ,   gene cloning