[만점보고서] 단백질의 분리와 정제_ion chromatography

소개글

[만점보고서] 단백질의 분리와 정제_ion chromatography에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 단백질 정제
1) buffer
2) buffer의 pH를 구할 수 있는 equation: Henderson Hassalbalch equation
3) 몰농도
4) buffer를 만드는 법, 계산과정
5)실험도구 및 과정

2. ion-exchange column chromatography
1)column chromatography의 원리
2)resin
-anion exchanger
-cation exchanger
3)elution (용출)
4)positive control & negative control
5)실험과정 및 도구

본문내용

를 흘려보낸다.
→bead packing을 평평하게 하는 이유: 이후 protein mixture가 골고루 내려가게 하기 위함이다.(만일 bead가 한쪽으로 쏠려있다면, bead가 쏠려있는 쪽으로 loading된 protein mixture는 많은 bead를 거치게 되고, bead가 없는 쪽으로 loading된 protein mixture는 적은 bead만 거치게 되기 때문)
5)protein mixture(PM) 1mL를 loading한다. 이때 protein mixture는 positive control로도 사용할 것이므로, e-tube에 protein mixture의 일부를 덜어, ice에 박아서 보관한다.
-유의할점: wash buffer를 pipetting할 때와 달리, protein mixture가 bead에 골고루 분사되는 것이 중요하기 때문에 packing된 bead가 최대한 흐트러지지 않도록 조심스레 pipetting한다. 그러나 너무 약하게 pipetting하여 방울방울 떨어질 경우에도 역시 bead가 패일 수 있기 때문에, 적당한 힘으로 pipetting하는 것이 중요하다.
6) protein mixture를 loading하자마자 흘러나오는 flow through(FT) (positive charge 혹은 neutral charge의 proteins)는 negative control로 사용할 것이므로, e-tube에 받아 ice에 박아서 보관한다.
7) bead washing 1mLx5: bead 사이사이에 (이온결합이 아니고) 물리적으로 붙어있는 기타 protein들을 빼내기 위해, bead를 wash buffer 1mL로 5번 wash해준다. 사전 실험을 통해 확인한 결과 bead wash를 5번 하면 protein이 거의 검출되지 않는 것을 확인하였으므로, wash를 5번 진행하는 것이다. 마찬가지로, pipetting시 wash buffer를 강하게 분사해준다.
8) elution: bead와 이온결합하고있는 negative charge의 protein들을, bead volume의 2배(1mL)인 NaCl을 통해 elution한다. 저농도의 NaCl(30mM)에서부터 고농도의 NaCl(200mM)을 사용하여, elution을 4번 진행한다. elution buffer도 bead에 골고루 분사되는 것이 중요하기 때문에, bead가 최대한 흐트러지지 않도록 조심스레 pipetting한다.
-30mM: bead와 약하게 이온결합하고있던 (-)charge의 protein들이 먼저 용출된다.→0.5mL씩 두 개의 tube(30-1, 30-2)에 순차적으로 나눠서 받는다. (먼저 받은 tube에는 더 약하게 이온결합하고있던 (-)charge의 protein들을 받게되고, 이후에 받은 tube에는 비교적 강하게 이온결합하고있던 (-)charge의 protein들을 받게된다.)
-100mM: 이전보다는 bead와 강하게 이온결합하고있던 (-)charge의 protein들이 용출된다.→역시 0.5mL씩 두 개의 tube(100-1, 100-2)에 순차적으로 나눠서 받는다.
-150mM: 이전보다는 bead와 강하게 이온결합하고있던 (-)charge의 protein들이 용출된다. →역시 0.5mL씩 두 개의 tube(150-1, 150-2)에 순차적으로 나눠서 받는다.
-200mM: bead와 강하게 이온결합하고있던 (-)charge의 protein들이 용출된다. →역시 0.5mL씩 두 개의 tube(200-1, 200-2)에 순차적으로 나눠서 받는다.
-유의할 점: ①0.5mL씩 나누어서 받아야하므로, 표시된 부분이 되면 빠르게 e-tube를 교체해주어야 한다.
②elution buffer가 다 떨어지고 나면, bead가 마르기 전에 다음 단계의 elution을 진행해야 한다.
③e-tube에 elution된 protein을 받고 나면, 손 온도로 인해 protein이 변성될 수 있으므로 protein이 담긴 쪽은 손으로 잡지 않는 것이 좋다. sample이 담긴 e-tube는 ice에 박아서 보관한다.
→결과적으로 8개의 sample e-tube와, positive control인 protein mixture(PM) e-tube, negative control인 flow through(FT) e-tube를 얻었다. Total 10개의 e-tube를 얻었다.
9) bead regeneration: 사용한 bead는 regeneration을 통해 재사용이 가능하다. 매우 고농도(2M)의 KCl 혹은 NaCl을 treat하여 이온결합이 되어있는 protein들을 모두 제거한 뒤, 보존용액(20% ethanol이나 sodium azide)을 넣은 1:1 slurry 상태로 4℃에 보관하면 재사용이 가능하다. (이 과정이 필수적인 것은 아니며, 오늘의 실험에서는 이 과정을 진행하지 않았다.)
*실험도구(materials)
column, column을 받칠 stand, DEAE bead, protein mixture, e-tube, elution buffer(30mM, 100mM, 150mM, 200mM NaCl), 기본 Tris-HCl buffer, pipette, tip, ice
1)ice: protein은 매우 변성되기 쉬우므로, ice에 박아서 보관한다.
2)e-tube: elution한 sample과 PM, FT를 받는다.
3)기본 Tris-HCl buffer: bead wash에 사용한다.
4)elution buffer(30mM, 100mM, 150mM, 200mM NaCl): elution에 사용
*References
[1] Haddad, Paul R., and Peter E. Jackson. Ion chromatography. Elsevier, 1990.
[2] Jackson, P. E. (2006). Ion chromatography in environmental analysis. Encyclopedia of Analytical Chemistry: Applications, Theory and Instrumentation.

키워드

ion-exchange column chromatography,   column chromatography,   chromatography,   resin,   anion exchanger,   cation exchanger,   positive control,   negative control,   단백질 정제