효소의 활성 실험_Enzyme activity assay_예비레포트 [A+]

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목차

1. 실험 목적
2. 바탕 이론
3. 기구 및 시약
4. 실험 방법
5. 참고 문헌

본문내용

지나면서 dI만큼 빛의 세기가 약해지기 때문에 부호는 -로 나타낸다.
(k와 는 비례상수)
② Beer 법칙
- 흡수된 빛의 분율은 물질의 농도와 비례한다는 법칙으로, 물질의 농도가 증가한다는 것은 물질의 두께가 두꺼워지는 것과 같은 효과를 보이기 때문에 위의 식에서 k는 농도인 c와 비례한다.
(는 비례상수)
지금까지의 Lambert 법칙과 Beer 법칙을 모두 고려하면 는 물질층의 두께인 b에 비례하며, 또한 용액의 농도인 c에 비례하므로 그의 곱인 bc에도 비례한다. 따라서 Lambert-Beer법칙에 의해 다음과 같은 식이 성립한다.
(a는 새로운 비례상수)
이 식을 흡광도에 관해 정리하면 다음과 같이 나타낼 수 있다.
A = 물질의 흡광도
= 투과 전 빛의 세기
= 투과 후 빛의 세기
= 몰흡광계수 []
b = 빛이 통과한 거리 []
c = 몰농도 []
※ Lambert-Beer법칙의 한계
① 빛을 흡수하는 분자들이 서로 다른 분자들에 영향을 미치지 않는 이상용액이다.
② 전자기복사선은 단색화된 빛이다.
③ 시료 물질에서는 빛에 대해 오직 흡수만이 일어난다.
3. 기구 및 시약
(1) 실험 시약
① Candida antarctica lipase B solution (CalB)
② 50mM p-nitrophenyl butyrate (pNPB)
Fig 10. CalB
- 지방가수분해효소인 lipase의 한 종류로, p-NPB의 분해 반응을 돕는 효소이다. 또한 지방의 ester기 수화반응을 유도할 수 있으며, 반대로 ester화 반응에도 관여할 수 있다.
Fig 11. p-NPB
- 화학식 :
- 분자량 : 209.2g/mol
- MSDS :
- 이번 실험에서 lipase 효소의 기질로 사용되며, 가수분해되어 노란색을 띠는 p-nitrophenol을 생성한다.
③ 50mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)
④ DDW (Double Distilled Water)
Fig 12. Tris-HCl buffer
- Tris ()에 을 첨가해 pH를 조절해 생물체 내의 pH와 비슷한 7.5 정도로 만든 완충용액이다. 완충작용을 통해 pH를 일정하게 유지하게 해준다.
Fig 13. DDW
- 2차 증류수로, 이번 실험에서는 UV-Vis spectrophotometer의 zero point를 맞출 때 사용한다.
(2) 실험 기구
① Micropipette 5ml, 1ml, 10μl
② Cuvette
Fig 14. 마이크로피펫
- 미량 분석에서 이용되는 미량 액체의 부피를 정확하게 채취, 배출시키기 위한 기기이다.
Fig 15. Cuvette
- 액체에 대한 빛의 흡수를 측정할 때 측정할 시료를 넣는 용기이다.
③ UV spectrophotometer (분광광도계)
④ Shaking incubator (진탕배양기)
Fig 16. 분광광도계
- 자외선 파장을 조사하여 물질의 광 흡수 현상을 이용해 미지의 시료가 흡수하는 빛의 파장과 그때의 흡광도를 측정하는 장치
Fig 17. Shaking incubator
- 미생물을 접종한 액체 배지를 흔들어 그 움직임으로 공기 중의 산소의 이동을 촉진시켜 배양하는 장치이다. 이번 실험에서는 호기성 균 및 세포의 배양을 위해 사용한다.
⑤ 250ml laboratory bottle
(= Duran bottle )
⑥ Aluminium foil
Fig 18. Duran bottle
- 시약 및 샘플 보관에 사용하며, 변성이 되지 않는 실험용 유리용기이다.
Fig 19. Aluminium foil
- 포장재나 단열재로 쓰이며, 이번 실험에서는 p-NPB의 광분해를 방지하기 위해 사용된다.
4. 실험 방법
< 용액 제조 >
① 50mM Tris-HCl buffer 998μl + CALB 2μl
→ 500배 희석한 CALB 1ml
② Acetonitrile 9.912ml + p-NPB 0.088ml
→ 50 mM p-NPB 10ml
(1) 호일을 감싼 bottle 2개를 준비하여 각 bottle에 54.45 ml의 50mM Tris-HCl buffer와 0.55 ml의 50 mM p-NPB를 넣어 0.5 mM pNPB 용액을 만들고 vortexing한다. (※ 가능한 빛을 받지 않도록 한다.)
(2) 대조군으로 한 개의 bottle에는 효소를 넣지 않고, 다른 한 개의 bottle에는 500배 희석한 효소(calB)를 20 μL 넣어준다.
(3) 반응 전 1 ml를 sampling하여 반응의 초기값(0min)을 UV-Vis spectrophotometer를 이용하여 405 nm 파장대의 흡광도를 측정한다.
(4) 두 개의 bottle을 shaking incubator에서 40 ℃, 150rpm으로 반응시킨다.
(5) 10분, 20분, 30분, 40분 총 4번 흡광도를 측정하여 측정한 data를 바탕으로 Abs 405/min의 그래프를 그리고, 아래의 식을 이용하여 효소의 specific activity (U/mgenzyme )를 계산한다.
※ 실험 시 유의사항
- p-NPB는 광분해될 수 있으므로 호일로 감싸야 한다.
- 흡광도 측정할 때 UV-Vis spectrophotometer에 외부 빛이 들어가지 않도록 한다.
- Sampling할 때 정확한 흡광도 측정을 위해 cuvette에 지문이 묻지 않도록 주의한다.
- 측정한 흡광도가 1이 넘으면 시료를 희석하여 실험을 진행해야 한다.
5. 참고 문헌
- Charles N. Satterfield, Heterogeneous Catalysis in Industrial Practice,\" 2nd ed., McGraw-Hill, Inc. (1993).
- W Mantele, E Deniz, UV-VIS absorption spectroscopy :Lambert-Beer reloaded, Elsevier, 173 , page 965-968, (2017).
- Shimadzu., The Relationship Between UV-VIS Absorption and Structure of Organic Compounds, (2017).

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