cell culture및 virus infection에 관한 실험

소개글

cell culture및 virus infection에 관한 실험에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1.cell culture

2.virus infection

3.protein extract

4.Bradford method

5.western blotting
< References >

본문내용

알려져 있다. 이것은 녹색으로 발색하는 시약으로서 감도도 좋고, 면역조직 화학실험에 도 널리 이용되어지고 있다. 한편, 미약하지만 발암성이 있기 때문에 주의하여 취급하여야 한다. 화학 발광법에는 membrane을 반응액과 반응시킨 후 발생되어진 X선 film에 의하여 검출한다. 고 감도로서 contrast도 좋고, 사진촬영도 쉽다. AP의 검출법에는 BCIP/NBT를 기질로 이용한 발색 법과 CDP-Star, 또는 CSPD를 이용하는 화학 발광법이 있다.
[ECL solution]
ECL solution은 두 개로 구성되어 있다. 하나는 루미놀이 들어있는 solution이고 하나는 과산화 수소와 enhancer가 들어있다. 과산화수소와 enhancer가 들어있는 solution은 공기에 아주 오래 노출되지만 않는다면 크게 문제없다. 그러나 루미놀은 그렇지 않다. 너무 오래 노출되면 노란 빛깔 을 띤다. 이렇게 색이 바랜 ECL을 사용하게 되면 효과가 현저히 떨어지게 된다.
지금부터의 실험은 모두 암실에서 이루어진다. 암실에서 준비해야 할 것들은 water, developer, fixer, timer, 발색시약(ECL), pipet, tissue, tip, wastebasket 등을 준비한다. 먼저 membrane을 tissue로 PBS를 조심스럽게 닦는다. 그런 다음 ECL을 골고루 뿌려준다. ECL에는 secondary antibody에 부착된 enzyme과 반응하는 substrate물질이다. enzyme과 ECL의 substrate물질이 반응하게 되면 발색을 일으키게 된다. para film 위에 membrane을 놓고, 발색시약(ECL)을 뿌린 후 주위에 흘러내린 ECL을 닦아준 후, membr
ane위에 또 한 장의 para film을 덮는다. 이때 공기가 차지 않도록 주의한다. Autoradiogra
phy용 cassette에 film을 넣은 후 1분정도 지난 후에 ⑥ X-ray 촬영. 암실에서 Xtjs 필름을 한 장 꺼내어 Autoradiography용 cassette에 para film으로 싸여있는 membrane위에 얹어 놓는다. membrane과 X선 film을 놓을 때 특정한 기준을 두는 것이 나중에 maker와비교하기가 편하다. ⑦ 현상. 10초~60초정도 지난 후에 cassette를 열어 film을 꺼내 deve loper에 담근다. 조금 기다리면 상이 나타나게 된다. 상이 나타나면 곧바로 water에 넣어 현상을 정시시킨다. 그런 다음 fixer에 넣어 현상을 정착시킨다. 처음에는 1분으로 하였는데 너무 어둡게 나와서 여러 번 시도 끝에 10초로 하였을 때가 가장 깔끔하게 나왔다.
그래서 우리의 실험 결과를 보면 왼쪽 사진과 같으며, 위의 결 과는 Infected protein에 Primary antibody (α-VP2)를 1:200
으로 하여 반응시킨 후, Secondary antibody (α-VP2)를
1:2000으로 하여 반응시킨 것이다.
이것을 western blot하여 10sec exporure 한 후, develope 한 것이다. 우리가 target으로 하는 infected protein의 size는 30kDa이며 왼쪽 사진의 30kDa 위치의 band를 관찰하면 순서 는 다음과 같으며
① NC(Negative Control)
② HeLa Infection with CVB3 (100)
③ HeLa Infection with CVB3 (10-1)
④ HeLa Infection with CVB3 (10-2)
⑤ HeLa Infection with CVB3 (10-3)
NC 에는 virus를 infection하지 않았기 때문에 30kDa 위치에 infected protein이 나타나지 않았으며, CVB3 원액을 infection 시킨 ②번의 band가 가장 진하게 나타났다. 이것은 infected protein의 양이 많음을 의미한다. 그 뒤로 ③,④,⑤의 순으로 갈수록 30kDa 위치의 band가 연해지는 것을 볼 수 있는데 이것은 ⑤로 갈수록 희석배율이 높아져서 infection한 virus의 양이 감소했기 때문에 infected protein의 양이 점점 줄어들기 때문이다.
[문제발생원인]원인
대책
Band가 많이 나타날 때
항체의 희석률과 특이성 문제
영동한 단백질량이 너무 많을 경우
block이 제대로 안 된 경우
일차 항체의 농도 검정을 다시 측정
이차 항체의 농도를 검정한다.
일차 항체를 affinity 정제한다.
영동한 단백질량을 측정한다.
blocking을 1시간 이상 overnight 한다.
Band가 전혀 나타나지 않음
항체역가가 약하거나 희석률이 부적당
block이 약할 경우
항원이 적을 경우
검출법이 적당하게 없을 때
적당한 buffer가 없을 때
반드시 알고 있는 일차항체를 positive control로 하고,
일차항체, 이차항체의 농도 검정을 다시 할 것.
blocking을 1시간으로 늘리고, 일차항체를 overnight반응.
영동한 단백질을 증가시킨다.
DAB법으로 검출되지 않을 경우 화학 발광법으로 검출.
Tween-PBS를 Tween-TBS 등으로 교환.
Membrane 전체가 검을 경우
blocking이 불충분
항체가 변성하여 있는 경우
반드시 Tween을 넣은 blocking액을 사용하고, overnight.
표식한 proteinA로 검출한다.

1. 한국생화학회 교재편찬위원회/실험 생화학/탐구당/2004/pp.74~100,399~402
2. 김태전외2인 / 세포배양학개론 / 고려의학 / 2004 / pp.173~262
3. 박인국/생화학 길라잡이/라이프사이언스/2004/pp.118~119
4. 안용근/효소 단백질 정제법/양서각/1994/pp.182~221
5. 단백질 실험 노트/ 월드사이언스/pp.1~40
7. 세포 배양 노트/ 월드사이언스/pp.1~69
6. http://google.com
7. http://apollo.mokpo.ac.kr/%7Esjkim/cgi-bin/technote/read.cgi?board=lab_bbs&y_
number=13&nnew=2

키워드

세포,   western blot,   virus,   bradford