Plasmid DNA 분리의 원리

본문내용

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Ethanol : 2 ~ 2.5 volume
final 0.3 M sodium acetate, pH 5.2 :
commonly used
final 0.2 M sodium chloride
DNA containing SDS
final 2 M ammonium acetate
triphosphate removal
inhibits T4 polynucleotide kinase and TdT
final 0.8 M lithium chloride
RNA precipitation, very soluble in ethanol
inhibits reverse transcription
Isopropyl alcohol : equal volume
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일반적으로 DNA를 침전시켜 농축시킬 때는 위와 같은 alcohol 침전법을 많이 사용합니다. 주로 ethanol이 많이 쓰이며, 알콜 침전시에는 monovalent salt ion(sodium 이나 potassium 등)이 필요한데, 위와 같이 여러가지를 쓸 수 있으며 목적에 따라서 골라서 씁니다. 예를 들어 전단계까지 SDS를 쓴 경우는 용액에 SDS가 들어 있으므로 NaCl을 salt로 쓰는 것이 좋습니다. 일반적으로는 sodium acetate와 ethanol의 조합을 가장 많이 씁니다.
원심분리(15,000 rpm, 4°C, 10분)하여 상층액을 완전히 제거합니다. 하얀 침전물이 DNA입니다. 여기에 약간의 단백질과 RNA가 그대로 섞여 있을 수 있습니다.
침전물이 보입니까? 이렇게 쥐꼬리만한 거 가지고 어떻게 실험하느냐는 말들을 하지요. 쪼잔하다면서요. 하지만, 이 세계는 이렇듯 "마이크로"의 세계입니다.
이제 침전물을 TE, pH 8,0 용액에 녹입니다. 이 때 RNase A를 함께 넣어 처리하면 좋습니다. RNase A는 20 ug/ml 정도로 처리한다고 하지만 경험적으로는 조금 과량 넣어주는 것이 좋은 것 같습니다.
RNase A를 넣었을 경우에는 37°C에서 30분 정도 처리합니다. 그 다음 RNaseA를 포함해서 남아있는 단백질들을 제거해야 합니다. 이렇게 RNA와 단백질을 제거하지 않으면 나중에 제한효소 처리나 sequencing 반응이 제대로 되지 않습니다.
단백질를 없애는 것은 phenol 처리로 합니다. 사용하는 시약은 phenol/chloroform/isoamyl alcohol이 25:24:1(v/v/v)로 섞인 것입니다. 이런 비교적 간단한 시약들은 물론 파는 것을 사도 되지만 직접 만들어 쓸 수도 있습니다. 단지 중요한 것은 phenol이란 시약은 TE, pH 8.0으로 saturation이 되어 있는 시약이라야 한다는 것입니다.
같은 양의 이 시약을 넣고 vortex로 섞으면 사진처럼 전체가 뿌옇게 변합니다. 이렇게 되면 DNA 용액 속에 있던 단백질이 phenol과 접촉하면서 모두 변성됩니다. 변성된 단백질은 수용액에 녹지 않으므로 뿌옇게 침전됩니다.
이를 원심분리하면 위아래로 두 층으로 나뉩니다. 위 층이 aqueous phase, 즉 수용액으로서 DNA가 녹아있는 층이며, 아래 층이 organic phase로 유기용매층입니다. 변성된 단백질 찌거기가 두 층 사이(interphase)에 보이게 되므로, 이것이 딸려오지 않도록 상층액을 조심스럽게 떠서 새 tube에 옮깁니다.
상층액에 3 M sodium acetate, pH 5.2 용액을 1/10 부피로, ethanol을 2.5 부피로 첨가하고 -20°C나 -70°C에서 20분 이상 둡니다. 이 용액 속에서 핵산은 상당히 안정하기 때문에 DNA나 RNA를 오래 보관하고 싶으면 이런 상태로 두기도 합니다. Sodium acetate 용액의 pH는 5.2 짜리를 많이 써 왔는데, 최근에 나오는 책에는 이보다 높은 것을 사용하라고 되어 있기도 합니다. Ethanol은 품질이 좋은 Merck 사 제품을 쓰는 것이 좋습니다. 이 에탄올은 absolute ethanol이라 하며, -20°C에 보관하도록 합니다.
이를 원심분리하여 침전물을 얻습니다.
사진에는 나타내지 않았지만, 침전물에 70% ethanol을 약 500 ul 넣고 다시 원심분리하여 제거하면 더욱 정제된 DNA 를 얻을 수 있습니다. 이를 "washing step"이라 하고 반드시 사용하는 것이 좋습니다.
침전된 순수한 DNA를 TE, pH 8.0 용액에 녹입니다. TE, pH 8.0 용액은 Tris-Cl, pH 8.0 용액이 10 mM, EDTA, pH 8.0 용액이 1 또는 0.1 mM로 되어 있는 용액입니다. DNA 는 이름 그대로 산(acid)이기 때문에 수용액에 있으면 조금씩 pH가 낮아져 DNA가 손상된다고 하므로, 위와 같이 tris buffer를 넣어줍니다. 또한 DNA를 변형시키는 효소들은 magnesium과 같은 2가 이온을 필요로 하므로 EDTA 를 조금 넣어주면 이런 효소들로부터 DNA를 보호할 수 있습니다.
DNA가 눈에 보이기도 하고 양이 적으면 잘 보이지 않기도 합니다. 그러나 상당히 순수한 plasmid DNA가 분리되었습니다.
Supercoiled(closed circular) DNA와 open circular DNA
분리한 DNA를 그대로 전기영동하면 사진과 같은 결과를 얻을 수 있습니다. 분리가 아주 잘 되면 대부분 supercoiled form DNA만 보이지만 분리과정에서 작은 충격을 입어서 open circular form이 조금 나타날 수도 있습니다.
보통 DNA는 그림과 같이 supercoiled form으로 존재하지만, 한 쪽 strand에 nick이 생기면 supercoil이 풀어져서 open circular form이 됩니다.
실제로 같은 DNA가 supercoiled, linear, open circular form으로 존재할 수 있는데, 이들을 전기영동하면 같은 염기서열의 같은 크기 DNA라도 이동하는 거리가 제각기 다릅니다. Size marker로 쓰는 짧은 DNA는 linear form입니다. 이렇게 전기영동으로 size를 비교할 수 있는 DNA는 linear form DNA 뿐입니다.

키워드

Plasmid DNA 분리,   Alkali lysis method ,   SDS