생화학 실습

소개글

생화학 실습에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 완충액(Buffer)의 조제 (0.05M 구연산 완충액)

2. BRADFORD 시약을 이용한 단백질 정량

3. Plasmid purification by spin column (Miniprep)

4. Plasmid DNA digestion by Restriction enzyme

본문내용

er
viii) Elute with 50㎕ of elution buffer
R.T. 1' (Room Temperature)
13k, 30''
sup.
- 이 과정을 통해 column에 결합되어 있던 Plasmid DNA를 용출해내게 된다. 따라서 여과되어 아래의 tube에 들어간 것이 Plasmid DNA인 것이다.
x) Plasmid
III. Results
실험에 대한 결과물을 직접 확인하지는 않았습니다. 하지만 이는 Restriction Enzyme으로 절단한 후, Electrophoresis(전기영동)를 실시함으로써 알아볼 수 있습니다. 우리가 추출한 Plasmid의 경우 Size가 5.4kbps이므로, 결과물에 대한 전기영동 Size를 확인함으로써 결과물을 평가할 수 있습니다.
IV. 직접적인 실험 결과에 대한 확인은 다음 실습시간에 실시하기로 했습니다. 따라서 실험이 정상적으로 이루어졌는지에 대해서는 다음시간에 확인할 수 있을 것입니다.
5월 19일 네 번째 실험
Plasmid DNA digestion by Restriction enzyme
I. Introduction
Plasmid DNA를 Restriction enzyme으로 절단해보는 실험과 동시에, 지난 실험에서의 Plasmid DNA 추출의 결과도 확인하는 실험을 실시했습니다.
자연 상태의 Plasmid DNA의 경우 Closed Circular DNA의 형태로 존재하게 됩니다. 이러한 상태에서 전기영동을 하는 경우에는 원래의 Plasmid DNA의 크기인 5.4kbps보다 작은 3kbps정도에 위치하게 됩니다. 그리고 Plasmid DNA의 2중쇄 중에 하나가 끊기는 Nick이 생길 경우, Open Circular DNA의 형태를 취하게 됩니다. 이는 5.4kbps보다는 작고 3kbps보다는 큰 5kbps정도에 위치하게 됩니다. 그리고 Restriction enzyme에 의해 절단되면, Linear DNA의 형태를 취하게 됩니다. 이러한 상태에서 비로소 실제 Size인 5.4kbps에 위치하게 됩니다. 따라서 Plasmid DNA가 Restriction Enzyme에 의해 완전하게 잘리게 된다면, 5.4kbps의 위치에 띠가 선명하게 보일 것입니다. 이를 확인하는 것이 이번 실험에 목표입니다.
II. Materials & Methods
◎ 시약 및 기구
Plasmid DNA, Restriction enzyme(Pst I), H buffer, Water Bath(항온수조), H buffer, pipette, tips
i) 다음과 같은 비율로 혼합한다.
Contents
Plasmid DNA
5㎕
Distilled Water
6.5㎕
10× H buffer
1.3㎕
Pst I
0.2㎕
Total volume
13㎕
ii) 위와 같이 혼합한 mixture를 37℃의 Water Bath(항온수조)에 30분간 넣어 놓는다.
- 이는 Restriction enzyme(Pst I)이 활성상태에서 Plasmid DNA를 digestion하도록 한다.
iii) Restriction enzyme에 의한 Plasmid DNA의 digestion 확인
- 위의 mixture에 형광을 띠는 시약을 첨가한다.
- pipette을 이용해, 전기영동기의 agar에 mixture를 넣는다.
- pipette으로 agar를 깊게 찔러 구멍을 내는 일이 없게 주의한다.
III. Results
위의 사진에서 화살표로 표시된 것이 제가 실험한 결과입니다. 나름대로 5.4kbps의 띠를 선명하게 볼 수 있었습니다. Plasmid DNA의 추출과 Restriction enzyme에 대한 결과를 동시에 확인할 수 있는 실험이었습니다.

키워드

생화학,   buffer,   bradford,   단백질 정량,   miniprep,   restriction enzyme,   제한효소