단백질의 정제(시료의 준비 및 순도확인)

소개글

단백질의 정제(시료의 준비 및 순도확인)에 대한 보고서 자료입니다.

목차

Approaches to protein stabilization
Introduction
Lyophilization
Micropurification of proteins

Protein characterization
Introduction
Functional study
Evidence of purity
1. SDS-PAGE
2. Isoelectric focusing
3. two dimensional electrophoresis
4. capillary electrophoresis
5. HPLC
6. Mass spectrometry

Molecular mass determination : mass spectrometry

본문내용

cid와 2,5-dihiydroxy benzoic acid 등이 있다. 이 혼합체는 건조된 후에 UV 광자에 의해 생성된 laser로 폭발하게 한다. matrix molecule들은 UV를 흡수하여 급격한 matrix-단백질 격자의 붕괴를 야기하고 이는 gas 상태가 된다. 흥분상태의 matrix 분자로부터 단백질로의 광자의 이동은 이후에 이온화를 일으킨다. 이렇게 가속화된 단백질 이온은 ionization point로부터 떨어져 강력한 전지강의 영향을 받는 analyser tube로 떨어지게 된다. Mass analyser는 그것들의 분자-charge ratio(m/z)에 따라 이온들을 분리해낸다.
time-of-flight(TOF) analyser는 이름에서 말해주듯 tube 끝에 있는 detector에 도달하는데 걸리는 시간을 측정하는 방법이며 일반적으로 MALDI로 생성된 단백질 이온과 연계해서 사용한다(MALDI-TOF). 그것들이 analyser tube를 통과할 때 protein ion들은 기본적으로 같은 역학적 에너지와 charge를 가지고 있기 때문에 오직 그것의 분자량에 의해서만 detector에 도달하는 시간에 차이가 생긴다. 이 때 작은 분자일수록 날아가는 속도는 빠르다. MALDI-TOF는 강함 Vacuum이 있는 상태로 동작되기 때문이다.
MS는 500kDa이상의 크기를 가진 단백질의 분자를 정확하게 측정 할 수 있다. 이것의 정확도는 0.01 퍼센트 정도이다(SDS-PAGE의 경우에 분자량 예상은 5~10퍼센트 정도밖에 되지 않는다.) 단지 수 picojoule의 분자만 있어도 특정이 가능한데다 이론적인 분자량과 실제 분자량을 비교함으로서 단백질의 modification이나 post-translational processing이 일어났는지 증명이 가능하다. 예를 들어 실제의 분자량이 이론적인 분자량에 비해 80Da정도 크다면 phosphate나 sulfate 그룹이 아마도 존재할 것이다.
분자량뿐만 아니라 MS는 단백질 서열 데이터를 만들어내는데도 이용가능하다. 서열 분석은 tandem(2인용의, 2개의, 2개가 붙은) mass spectrometer(즉 MS/MS)가 필요하다. 이는 두 개의 mass analyser tube가 순차적으로 이어져 있고 collision cell만이 분리되어있다. 서열 분석될 단백질은 맨 처음에 화학적, 물리적으로 잘려진다. 그 fragment들은 처음 analyser tube에서 분리되고 하나의 선택된 peptide ion fragment는 홀로 collision tube에 넣어져 주입되는 가스분자(He 또는 Ar)와 충돌한다. 이는 더욱 더 fragmentation되어 그 peptide의 전체 서열 범위 정도까지 분해된다.
두 번째 tube에서 생성된 각각의 fragment들의 분자량을 전산화 하여보면 그것의 완전한 서열을 알 수 있다. mass spectrum의 분석은 복잡하지만 이는 몇 가지의 잠재적인 장점을 가진다.
1. 이는 block 되었거나 modify된 peptide의 서열로부터 서열정보를 얻을 수 있게 한다.
2. 이는 Edman degradation(Chap 1에서 언급되었다고 함) 보다 빠르다
3. 이는 Edman technic만큼이나 고감도이다.
단백질의 분자량을 결정하는 추가적인 방법에는 gel filtration과 non-denaturing electrophoresis, 그리고 analytical ultracentrifugation이 있다. 이전에 간단히 설명한 바와 마찬가지로 gel filtration은 단백질을 크기와 모양에 따라서 분리한다. 대부분의 구형 단백질들은 거친 구체의 형태를 띠는데 그것들의 분리는 필수적으로 mass에 달려있다. gel filtration에 의한 질량 분석은 초기에 gel filtration column을 protein standard를 이용하여 조정해야 한다(table 3.16에 나와 있는 것처럼 분자량이 알려진 구형단백질). Log molecular mass가 단백질 elution volume에 따라 구성되었을 때, 이는 1차 함수 관계를 갖는다. standard curve는 그것의 분자량이 알려진 단백질과 동등한 elution volume을 사용하였을 때 그려질 수 있다.
non-denaturing PAGE는 단백질을 크기와 모양, 그리고 전하에 따라 분리한다. non-denaturing 시스템은 Ferguson plots를 만들어내는데 이용될 수 있으며, 이는 다시 말해 단백질의 분자량을 측정하는데 이용이 가능하다. 어떤 주어진 단백질을 non-denaturing PAGE 할 때 단백질이 gel을 통과하는 상대적인 이동성(Rf)은 gel의 acrylamide 함량을 높였을 때 감소한다. 주어진 단백질에 대해 여러 다른 acrylamide 농도로 만들어진 gel을 이용하여 running함으로서 Rf와 acrylamide의 농도에 대한 그래프가 구해진다(a Ferguson plots). 일직선의 line이 관측되는데 그 때 그 경사를 Kr(retardation efficiency)라고 부른다. 큰 단백질은 작은 단백질보다 큰 Kr값을 갖는다. 분자량이 알려진 몇 가지 단백질에서 이 Kr 값을 정함으로서 Kr과 분자량에 대한 standard curve가 그려질 수 있다. 그 분자량이 알려지지 않은 단백질의 Kr 값이 이후에 측정이 되고 앞에서 만든 standard curve에 그 수치를 대입하여보면 그 물질의 분자량이 얻어진다.
analytical ultracentrifugation 또한 단백질의 분자량을 결정하는데 이용이 가능하다. 이는 단백질에 대해 단백질이 원심분리 tube를 통해 이동하게끔 강한 원심력을 부여하는 과정이 수반된다(rotor를 60,000rpm 이상의 속도로 한다). 이는 특별히 고안된 sample cell을 이용함으로서 이루어진다. 이것의 결과를 바탕으로 단백질의 sedimentation coefficiency(s)가 정해진다. 이 값은 svedberg 공식이라고 알려진 수식에 의해 단백질의 분자량으로 환산이 가능하다.

키워드

단백질(protein),   정제(purification),   동결건조(lyophylize),   질량 분석(mass spectrometry),   단백질 정제