[식물생리학]제한효소 DNA 절단과 전기영동법과 PCR에 의한 DNA분리 및 확인

본문내용

PCR 반응 혼합물의 제조
1) 반응 혼합물의 양
- 최종 반응액은 10, 25, 50, 100 등으로 조절할 수 있으며 증류수(DW)는 최종
반응액의 양에 따라 결정한다.
2) dNTP
- dATP, dTTP, dGTP, dCTP가 각각 2.5mM이 되도록 혼합한다.
- 서로의 농도가 틀리면서 잘못 들어 갈 경우 polymerization 속도가 느려지면서
중간에서 멈추게 된다.
3) Oligonucleotide primer
- 농도는 250nM에서 1uM까지 조정할 수 있다.
- primer의 길이는 증폭의 특이성을 위하여 15-30bp가 좋다.
- primer양이 너무 많으면 nontarget sequence가 증폭되어 특이성이 줄어들 수가
있으므로 이런 경우는 primer양을 줄여야 한다.
- primer의 sequence는 서로 complement하면 primer dimer가 만들어질 수 있다.
- primer의 G+C content는 50% 정도가 되게 해야 specificity가 높다.
4) 시료(template DNA)
- 농도는 1ug/100ul까지 가능한데 대개 0.4ug/100ul의 농도로 사용하면 증폭이 잘
된다. 처음에는 충분한 양으로 시작하여 원하는 결과가 나오면 DNA양을 차차
줄여 반응을 최적화 한다.
- plasmid가 genomic DNA보다 훨씬 PCR이 잘되며 일반적으로 50-500bp 정도
의 길이가 가장 수월하게 증폭된다.
- Protease 같은 단백질이 sample DNA에 많으면 PCR을 시작하기 전에
에서 5분간 끓여 효소를 불활성화 한 후 PCR을 시작한다.
5) MgCl2
- Taq polymerase의 작용을 위해서는 MgCl2가 필수적이며 대개 1.5mM가 적절
하나 경우에 따라서는 1.5-4mMwjd도까지 실험하여 최적의 농도를 찾아야 한다.
6) 마스터 혼합물(master mix)
- PCR sample의 수가 많을 경우에는 DW, buffer, dNTP, primer, Taq
polymerase 등을 미리 혼합하여 master mix를 만들어 각 tube에 넣고 MgCl2과
template DNA만 각각 첨가하여 사용하기도 한다.
7) 미네랄 오일
- PCR이 진행되는 동안 반응 혼합물의 증발을 막기 위해 1-2방울 떨어뜨린다.
PCR 기계에 따라 혼합물의 증발을 막아주는 경우가 있어 미네랄 오일이 필요
없는 예도 있다. ( ex) tube cap의 윗부분에도 가열장치가 되어 있는 장비 경우)
(2) PCR의 구성
1) 초기 DNA denaturation
- 처음에 94-95에서 5-10분간 반응시켜 DNA를 충분이 denaturation 시킨다.
2) DNA의 증폭 위하여 다음의 3cycle을 반복하여 대개 25-35 cycle을 시행한다.
a) Denaturation: dsDNA을 ssDNA로 만든다.- 96, 30초-1분
b) Annealing: primer가 ssDNA에 붙는다- 40, 30초-1분
-일반적으로 높은 annealing temperature에서 더욱 specific product를 얻는다.
최적 온도는 실험을 반복해서 얻어지나 primer의 G+C content가 높을수록
높은 온도가 필요하다.
c) Extension: primer를 기점으로 DNA가닥을 합성한다.- 68 30초-2분
- Taq polymerase의 경우 1분당 2000-4000 base의 extension rate를 갖는다.
3) Final extension
- 일부 불완전하게 합성된 PCR product의 마무리 중합반응을 위해 충분한 시간
(5-10분) 소비하여 반응이 모두 끝나면 40에 저장한다.
4. 참고 문헌
- http://kbiotec.kijeon.ac.kr/edu_program/pcr_2.asp
- http://cri.snuh.org/crinew/CRIIntroduce/LAB/bioinformatics/bioinfor.html
- http://www.bmskorea.co.kr/molecular03-1-1.htm
- http://chshin5.netian.com/sciensense/heredity-engin.htm
- http://www.immunoblot.com/westblot.htm
- http://bio.yu.ac.kr/enzyme.html
- http://uniweb.unitel.co.kr:8083/class/biology/lesson/biologyI/sts/future/future5.html
- http://dasan.sejong.ac.kr/%7Eyjlee/p-restriction%20enzyme.htm
- http://www.snp-genetics.com/korea/geno2_k.htm
- http://khmc.or.kr/%7Eyoungkmc/particle/ch44_1.htm
1.실험 목적
2. 실험 원리
1) 제한 효소 (Restriction enzyme)
(1) 제한 효소의 정의
(2) 제한 효소에 대한 정리
(3) 제한 효소의 분류
2) DNA 조작에 관여하는 효소들의 종류
(1) Nuclease
(2) ligase
(3) polymerase
(4) modifying enzyme
(5) topoisomerase
3) 제한효소의 종류와 절단부위
4) 제한효소를 이용한 DNA의 절단시 고려할 사항들
5) 대표적인 DNA절단 제한효소와 절단 인식자리
6) 전기영동(electrophoresis)
(1) 전기영동의 정의와 원리
(2) 완충액
(3) Gel loading buffer
(4) DNA의 가시화(Visualization)
(5) 전류
7) PCR(Polymerase Chain Reaction)
(1) PCR이란?
(2) PCR에 필요한 재료
(3) PCR의 원리
(4) PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)
3. 실험 방법
1)제한효소 처리
(1) Metrial
(2) Method
2) 전기영동
(1) Method
(2) Gel 염색
3) PCR
(1) PCR 반응 혼합물의 제조
(2) PCR의 구성
4. 참고 문헌

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식물생리학,   제한효소,   DNA 절단,   전기영동법,   PCR,   DNA분리