[유전자조작실습] (A+) Crucial Methods of making copies with biological replication and storing safely a particular gene (Fusarium graminearum_00385) in Escherichia coli

소개글

[유전자조작실습] (A+) Crucial Methods of making copies with biological replication and storing safely a particular gene (Fusarium graminearum_00385) in Escherichia coli 에 대한 보고서 자료입니다.

목차

Abstract

Introduction

Materials and Methods

Results

Discussion

Discussion

본문내용

mid가 가진 항생제 내성을 가질 수 있다. 따라서 항생제 배지에서 키움으로 써 plasmid가 숙주에 잘 들어갔는지 확인할 수 있다. 우리 실험에서 pGEM-T easy vector는 ampicillin에 내성이 있기 때문에 LB agar 배지에 ampicillin을 깔고 conformation된 E. coli들을 키워 plasmid가 들어갔는지 확인한다. multiple cloning site는 여러 restriction enzyme이 자르는 장소이다. 따라서 원하는 gene을 알고 있는 장소에 넣을 수 있다. 먼저 ligation하기 전에 plasmid랑 삽입하고자 하는 gene을 모두 같은 restriction enzyme으로 처리해 주면, 대부분 sticky end를 만들기 때문에 plasmid와 gene 사이에 H-bond가 생긴다. 그래서 2개의 nick을 가진 원형 plasmid를 만들게 된다. 이때 ligase가 ATP를 이용하여 nick에서 nucleotide 사이에 phosphodiester bond를 만들어 완전한 원형을 만든다. Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losik // 2010년 2월 18일// 왓슨의 분자생물학 6판//p746-748
pGEM-T easy vector는 multiple cloning site에 LacZ gene이 존재한다. E. coli의 원래 genome에는 lac operon이 있다. operon의 operator에 repressor가 붙어 있어서 operator 앞부분의 promoter에 transcription factor가 작용하지 못하게 된다. 하지만 배지에 IPTG를 넣어주면, operator에 붙은 repressor와 결합하여 repressor을 operon에서부터 떨어뜨린다. 따라서 promoter에 TF가 붙어 발현이 된다. 이때 이미 Lac gene의 일부를 delete 해놨기 때문에 발현이 돼도 inactive beta-galactosidase가 만들어진다. 하지만 pGEM-T easy vector에 multiple cloning site에 있는 Lac gene이 발현되면 lac fragment가 나온다. 이 Lac fragment와 inactive beta-galactosidase가 만나면 active하게 된다. 따라서 배지에 깔아둔 X-gal이 beta-galactosidase에 의해 분해되어 blue를 띄게 된다. 따라서 blue colony를 띄는 것은 gene이 삽입 되지 못하고 self-ligation 되었다. 반면 plasmid의 lac gene에 잘 삽입이 되면 lac fragment가 만들어지지 않아서 x-gal이 분해되지 않고 white를 띈다. 또, ligation 할 때, vector와 DNA의 ratio를 잘 맞추는 것이 중요하다. 무조건 1:1이 아니라 길이, molar 농도를 참고 해서 맞춰야 한다. ligation이 잘 되었는지 확인하기 위해서는 cloning 까지 마쳐야 한다. cloning이 금방 끝나는 것이 아니라 오래 걸린다. 또, 제대로 colony가 뜨지 않았을 때는 ligation이 문제인지 cloning 어떤 과정에 문제가 있는 지 명확히 알 수 없기 때문에 문제의 원인을 찾는 것이 어렵다. 따라서 ligation 과정이 잘 되었는지를 확인 할 수 있는 방법을 발명 한다면 ligation 되지 않은 product를 cloning까지 해볼 필요가 없어지므로 시간을 단축 할 수 있다.
또, cloning 할 때, 가장 중요한 것은 conformation이다. conformation이란 숙주 생물체가 외부로부터 DNA를 취하는 과정이다. 대장균은 그렇지 않지만 몇몇 세균들은 자연적으로 이런 능력을 가지는 데, 이를 genetic competence(유전적 수용능)이라 한다. 그러나 대장균은 칼슘 이온을 처리하면 DNA를 흡수 할 수 있는 능력을 가질 수 있다. 아직 DNA 흡수 기작은 밝혀지지 않았지만 칼슘 이온이 DNA의 음전하를 막아 DNA가 세포막을 통과할 수 있게 된다. 따라서 칼슘이온을 처리해 genetic competence를 갖게 한 E.coli를 competent cell 이라 한다. Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losik // 2010년 2월 18일// 왓슨의 분자생물학 6판//p748
따라서 이번 실험을 통해서 연구하고자 하는 DNA fragment를 숙주로부터 뽑아내고, 증폭하고, 안전한 장소에 보관 하는 실험 기술을 배울 수 있었다.
Reference
MicrobeWiki // 2014.10.28. // Fusarium graminearum // MicrobeWiki // microbewiki .kenyon .edu(Classification, Pathology)
Broad Institute // 2014.10.28. // F. graminearum PH-1 (FG3): FGSG_00385 - hypothetical protein // Broad Institute // broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_group (FGSG_00385 search)
-5) cholongedna // 2007년 11월 28일 // EtOH ppt 및 PCI/CI extraction 하는 이유 좀 알려주세요 // naver // kin.naver.com/
George M. Malacinski // 2006년 1월 30일 // Essentials of Molecular Biology fourth edition // p42-43 denaturation
전문진 // 2003년 8월 20일 // 현대의 생물공학과 생명공학 // p 69-71 PCR의 기본 원리
Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losik // 2010년 2월 18일 // 왓슨의 분자생물학 6판//p746-748
Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losik // 2010년 2월 18일 // 왓슨의 분자생물학 6판//p748

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