Restriction Enzyme Digestion and Gel Electrophoresis

소개글

Restriction Enzyme Digestion and Gel Electrophoresis에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 실험제목
2. 실험날짜
3. 제출자 및 공동실험자
4. 실험목적
5. 실험원리
6. 시약 및 기자재
7. 실험방법
8. 결과
9. 고찰
10. 참고문헌
11. Further study

본문내용

10. Further study
ⅰ) Plasmid DNA sequence 내의 enzyme site가 있음에도 불구하고 restriction enzyme으로 digest 되지 않는 경우가 있다. 이런 현상의 요인 중에 하나로 특정 enzyme site가 methylation 되기 때문인데 이런 methylation이 필요한 이유가 무엇인가?
☞ bacteria에서 발견된 restriction enzyme은 자기방어 기작으로써 외부에서 들어온 DNA sequence를 인지하여 그 sequence의 특정 site를 자르게 된다. 이는 bacteria가 가지고 있는 DNA sequence도 잘릴 수 있는 것을 의미하는데 이것에 대하여 bacteria는 자신의 restriction enzyme에 의해 인식되는 DNA sequence를 methylation시키므로써 restriction enzyme이 DNA 상의 sequence를 reading 할 때 restriction enzyme이 인식할 수 있는 DNA sequence를 그냥 지나가게 된다. 그러므로 restriction enzyme에 의해 DNA damage 피해를 없에기 위해 methylation은 필요하다.
ⅱ) Enzyme digest가 잘 되지 않는 요인이 여러 가지가 있는데 methylation 외에 실험과정 중 무슨 요인에 의해 restriction enzyme이 잘 작용하지 않을까?
☞ Plasmid DNA를 E.coli에서 분리할 때 마지막 과정에서 70% ethanol을 사용하였다. 이는 70% ethanol안에 들어있는 30%의 물이 salt를 제거해주기 때문인데 salt가 DNA에 남아 있으면 restriction enzyme이 작용할 때 충분한 activity를 나타내지 않거나 혹은 restriction enzyme이 DNA에 작용하지 않을 수도 있다. 그 이유로는 DNA sequence는 기본적으로 phosphate에 의해 negative charge를 띠고 있는데 salt를 제거하지 않은 상황에서는 많은 positive charge가 DNA sequence 주위에 몰려 있게 되고 이것은 restriction enzyme이 DNA를 scanning하여 restriction site를 찾는 것을 방해하게 된다.
ⅲ) DNA size가 클 경우 vortex를 하면 안 되는데 그 이유는 무엇일까요?
☞ E.coli에서 plasmid DNA를 분리하는 실험에서 Sol Ⅱ을 처리한 후 vortex하는 것을 금지하였는데 그 이유는 E.coli안에 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA는 모두 Sol Ⅱ에 의해 denature되는데 이 때 강하게 vortex를 해주게 되면 크기가 큰 chromosomal DNA의 경우 DNA가 조각으로 잘리는 경우가 생기게 되고 나중에 Sol Ⅲ로 renature 시켜 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 분리한다고 할지라고 plasmid DNA가 남아있는 층에 chromosomal DNA에서 잘린 조각이 포함될 수 있기 때문에 vortex를 해주면 안 된다.
ⅳ) uncut plasmid DNA에서 여러 개의 bend가 나타나는 이유는?
☞ 기본적으로 uncut plasmid DNA를 gel에 걸어도 3개의 bend가 관찰된다. gel에서 DNA의 이동은 원리는 크게 두 가지로 나뉜다. 첫 번째가 size, 두 번째가 steric이다. 먼저 size가 작으면 가벼워서 멀리까지 이동가능하고, DNA의 steric이 작으면 멀리까지 이동가능하다. 여기서는 plasmid DNA의 size는 같기 때문에 DNA의 이동의 차이가 온 것은 steric의 영향 때문이다. 가장 가벼워서 멀리 이동한 순서대로 supercoiled DNA, circular DNA, nicked DNA가 그것이다. supercoiled DNA는 DNA가 가장 compact한 구조로 되어 있기 때문에 steric의 영향을 거의 받지 않고 이동가능하고, circular DNA의 경우 원형의 구조를 유지하고 있기 때문에 어느 정도 steric의 영향을 받을 것이고, nicked DNA는 double strand 중에서 single strand만이 잘린 것으로 이것은 linear form의 single strand DNA와 circular form의 single strand DNA를 가지게 된다. 그러므로 가장 큰 steric의 영향을 받기 때문에 이동거리가 가장 짧다.

키워드

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